Modélisation des métastases cérébrales par injection de cellules cancéreuses dans l’artère carotide interne

Summary

Les métastases cérébrales sont une cause de morbidité et de mortalité sévères chez les patients atteints de cancer. La plupart des modèles murins de métastases cérébrales sont compliqués par des métastases systémiques confondant l’analyse de la mortalité et des résultats des interventions thérapeutiques. Présenté ici est un protocole pour l’injection carotidienne interne de cellules cancéreuses qui produit des tumeurs intracrâniennes cohérentes avec des tumeurs systémiques minimales.

Abstract

Les métastases cérébrales sont une cause de morbidité et de mortalité sévères chez les patients atteints de cancer. Les aspects critiques des maladies métastatiques, tels que le microenvironnement neuronal complexe et l’interaction des cellules stromales, ne peuvent pas être entièrement reproduits avec des essais in vitro ; Ainsi, les modèles animaux sont essentiels pour étudier et comprendre les effets de l’intervention thérapeutique. Cependant, la plupart des méthodes de xénogreffe de tumeurs cérébrales ne produisent pas de métastases cérébrales de manière cohérente en termes de délai et de charge tumorale. Les modèles de métastases cérébrales générés par injection intracardiaque de cellules cancéreuses peuvent entraîner une charge tumorale extracrânienne involontaire et entraîner une morbidité et une mortalité métastatiques non cérébrales. Bien que l’injection intracrânienne de cellules cancéreuses puisse limiter la formation de tumeurs extracrâniennes, elle présente plusieurs mises en garde, telles que les cellules injectées forment souvent une masse tumorale singulière au site d’injection, une implication leptoméningée élevée et des dommages au système vasculaire cérébral lors de la pénétration de l’aiguille. Ce protocole décrit un modèle murin de métastases cérébrales générées par injection d’artère carotide interne. Cette méthode produit des tumeurs intracrâniennes de manière cohérente sans l’implication d’autres organes, ce qui permet l’évaluation des agents thérapeutiques pour les métastases cérébrales.

Introduction

Les métastases cérébrales sont une tumeur maligne prévalente associée à un très mauvais pronostic ^1,2. La norme de soins pour les patients atteints de métastases cérébrales est multimodale, comprenant la neurochirurgie, la radiothérapie du cerveau entier et / ou la radiochirurgie stéréotaxique en fonction de l’état de santé général des patients, de la charge de morbidité extracrânienne et du nombre et de l’emplacement des tumeurs dans le cerveau ^3,4. Les patients présentant jusqu’à trois lésions intracrâniennes sont éligibles pour une résection chirurgicale ou une radiochirurgie stéréotaxique, tandis que la radiothérapie du cerveau entier est recommandée pour les patients présentant des lésions multiples afin d’éviter le risque d’infection et d’œdème liés à la chirurgie⁵. Cependant, la radiothérapie du cerveau entier peut infliger des dommages aux structures cérébrales radiosensibles, contribuant ainsi à une mauvaise qualité de vie⁶.

La thérapie systémique est une approche alternative non invasive et logique pour traiter les patients présentant des lésions multiples⁷. Cependant, il est moins pris en compte en raison de la notion de longue date selon laquelle les thérapies systémiques ont une faible efficacité parce que l’administration passive de médicaments cytotoxiques par la circulation sanguine ne peut pas atteindre des niveaux thérapeutiques dans le cerveau sans risque de toxicité dangereuse⁸. Ce paradigme commence à changer avec le traitement systémique récemment approuvé par la Food and Drug Administration (FDA) des États-Unis (tucatinib avec trastuzumab et capécitabine indiqué pour les métastases cérébrales métastatiques du cancer du sein HER2+)9,10,11,12 et la mise à jour des lignes directrices de traitement pour inclure la prise en compte des options de traitement systémique pour les patients atteints de métastases cérébrales^13,14.

Dans ce contexte, les développements dans le domaine de la thérapie moléculaire ciblée, de l’immunothérapie et des systèmes alternatifs d’administration de médicaments, tels qu’un nano-transporteur de médicaments ciblé, peuvent potentiellement surmonter les défis du traitement des métastases cérébrales^15,16,17,18. En outre, des approches chimiques et mécaniques visant à améliorer l’administration de médicaments par perméabilisation de la barrière cérébrale-tumorale sont également à l’étude^19,20. Pour étudier et optimiser ces approches afin qu’elles soient adaptées à l’objectif, il est crucial d’utiliser des modèles précliniques qui non seulement reflètent la physiologie complexe des métastases cérébrales, mais permettent également une analyse objective de la réponse intracrânienne aux médicaments.

De manière générale, les approches actuelles pour modéliser les métastases cérébrales in vivo impliquent l’injection intracardiaque (ventricule gauche), intraveineuse (habituellement la veine de la queue), intracrânienne ou intracarotide (artère carotide commune) de cellules cancéreuses chez la souris 21,22,23,24,25,26,27 . Outre les stratégies de greffe de tumeur, les modèles murins génétiquement modifiés où la formation tumorale est déclenchée par l’élimination des gènes suppresseurs de tumeurs ou l’activation des oncogènes sont utiles pour la modélisation tumorale. Cependant, seuls quelques modèles de souris génétiquement modifiés produiraient des tumeurs secondaires et encore moins produiraient de manière fiable des métastases cérébrales^28,29,30.

Les méthodes de greffe telles que l’injection intracardiaque (ventricule gauche) et intraveineuse (généralement la veine de la queue) imitent la dissémination systémique du cancer. Ces modèles produisent généralement des lésions dans plusieurs organes (par exemple, cerveau, poumons, foie, reins, rate) en fonction du lit capillaire qui piège la plupart des cellules tumorales lors de leur « premier passage » ^{circulatoire31}. Cependant, des taux irréguliers de greffe de cerveau nécessiteront plus d’animaux pour atteindre la taille de l’échantillon pour la puissance statistique souhaitée. Le nombre de cellules tumorales qui finissent par s’établir dans le cerveau via ces méthodes d’injection intracardiaque et intraveineuse est variable. Par conséquent, la charge tumorale des métastases cérébrales peut varier d’un animal à l’autre et la différence de progression peut rendre difficile la normalisation du calendrier expérimental et de l’interprétation des résultats. La charge tumorale extracrânienne peut entraîner une mortalité par métastases non cérébrales, rendant ces modèles impropres à l’évaluation de l’efficacité intracrânienne. Des lignées cellulaires tropiques cérébrales ont été établies à l’aide de processus de sélection clonale artificielle pour réduire l’établissement extracrânien, mais les taux de prise ont été incohérents et le processus de sélection clonale peut réduire l’hétérogénéité normalement trouvée dans les tumeurs humaines³².

Les méthodes de greffe spécifiques au cerveau telles que l’injection intracrânienne et intracarotidienne permettent une modélisation plus cohérente et efficace des métastases cérébrales. Dans la méthode intracrânienne³³, les cellules cancéreuses sont généralement injectées dans le cortex cérébral frontal, ce qui génère une excroissance tumorale rapide et reproductible avec une faible atteinte systémique. Bien que la procédure soit bien tolérée avec une faible mortalité³³, les mises en garde sont qu’il s’agit d’une approche relativement rudimentaire qui introduit rapidement un bolus (localisé) de cellules dans le cerveau et ne modélise pas la pathogenèse précoce des métastases cérébrales. L’aiguille endommage le système vasculaire du tissu cérébral, ce qui provoque alors une inflammation localisée ^5,34. D’après l’expérience, il existe une tendance à l’injection de cellules tumorales au reflux lors du retrait de l’aiguille, conduisant à une atteinte leptoméningée. Alternativement, la méthode intracarotidienne délivre des cellules dans l’artère carotide commune avec la microvascularisation cérébrale comme premier lit capillaire à rencontrer, modélisant la survie dans la circulation, l’extravasation et la colonisation²⁴. En accord avec d’autres²⁵, notre expérience avec cette méthode a révélé qu’elle peut entraîner des tumeurs faciales en raison de l’administration involontaire de cellules cancéreuses via l’artère carotide externe aux lits capillaires de ces tissus (données non publiées). Il est possible de prévenir les tumeurs faciales en ligaturant d’abord l’artère carotide externe avant l’injection commune de l’artère carotide (Figure 1). Dans le reste de l’article, cette méthode est appelée « injection interne de l’artère carotide ». D’après l’expérience, la méthode d’injection de l’artère carotide interne génère systématiquement des métastases cérébrales avec très peu d’événements systémiques et a réussi à générer des modèles de métastases cérébrales de différents cancers primitifs (p. ex. mélanome, cancers du sein et du poumon) (Figure 1). Les inconvénients sont qu’il est techniquement difficile, long, invasif et nécessite une optimisation minutieuse du nombre de cellules et un calendrier de surveillance. En résumé, les méthodes d’injection intracrânienne et interne de l’artère carotide produisent des modèles murins adaptés à l’évaluation de l’impact thérapeutique sur le bénéfice de survie lié aux tumeurs cérébrales.

Ce protocole décrit la méthode d’injection de l’artère carotide interne pour produire un modèle murin de métastases cérébrales avec presque aucune atteinte systémique et donc adapté à l’évaluation préclinique de la distribution des médicaments et de l’efficacité des thérapies expérimentales.

Figure 1 : Représentation schématique du protocole d’injection de l’artère carotide interne pour les métastases cérébrales. L’injection interne de l’artère carotide avec ligature externe de l’artère carotide peut produire de manière fiable un modèle de métastases cérébrales à partir de divers cancers primaires. Dans ce protocole, trois ligatures sont placées sur l’artère carotide (annotées L1-L3 sur la figure). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Protocol

Toutes les études ont été menées conformément aux lignes directrices du Comité d’éthique animale de l’Université du Queensland (UQCCR/186/19) et au Code australien pour le soin et l’utilisation des animaux à des fins scientifiques. 1. Préparation des cellules cancéreuses pour injection REMARQUE: Dans cette étude, la lignée cellulaire du cancer du sein humain, BT-474 (BT474), a été utilisée. BT474 a été cultivé dans un milieu d…

Representative Results

Comparaison de l’injection courante de l’artère carotide avec ou sans ligature de l’artère carotide externeLorsque des cellules cancéreuses ont été injectées via l’artère carotide commune sans d’abord ligaturer l’artère carotide externe24, des tumeurs faciales ont été trouvées chez 77,8% des souris greffées (n = 7/9 animaux). Un exemple de tumeur faciale est illustré dans la figure supplémentaire 3. La méthode décr…

Discussion

Les métastases cérébrales sont un processus complexe par lequel les cellules cancéreuses se propagent de leur site primaire au cerveau. Différents modèles animaux sont disponibles qui reflètent certaines étapes de ce processus en plusieurs étapes et il existe des considérations physiologiques et pratiques dans la conception d’études précliniques sur les métastases^41,42. La plupart des études publiées sur l’utilisation de la nanomédecine pour l…

Materials

100µm cell strainer	Corning	CLS431752
30G Microlance needle	BD	23748
31G Ultra-Fine II insulin syringe	BD	326103
Angled forceps	Proscitech	T67A-SS	Fine pointed, angled without serrations, 18mm tip, length 128 mm
Animal heat mat
Antibiotic and antimycotic	ThermoFisher Scientific	15240062
Autoclave bags
BT-474 (HTB-20) breast cancer cell line	ATCC	HTB-20
Buprenorphine (TEMGESIC)
Countess cell counter	ThermoFisher Scientific	C10227
Diet-76A	ClearH2O	72-07-5022
Dissection microscope
Ear puncher
Electric clippers
Fine angled forceps	Proscitech	DEF11063-07	Angled 45°, Tip smooth, Tip width: 0.4 mm, Tip dimension: 0.4 x 0.3 mm, length 9cm
Fine tubing for cannula, Tubing OD (in) 1/32, Tubing ID (in) 1/100in	Cole Parmer	EW-06419-00
Foetal bovine serum	ThermoFisher Scientific	26140079
Hank's Balanced Salt Solution without calcium and magnesium	ThermoFisher Scientific	14170120
Hydrogel	ClearH2O	70-01-5022
Isoflurane
Kimwipes Low lint disposable wipers	Kimberly Clark- Kimwipes	Z188964
Mashed mouse chow
Meloxicam (METACAM)
Nose cone			Fashioned out of a microfuge tube
PAA ocular lubricant (Carbomer 2mg/g)	Bausch and lomb
Povidone-iodine solution	Betadine	2505692
PPE (glove, mask, gown, hairnet)
Retractors	Kent Scientific	SURGI-5001
RPMI 1640 Media	ThermoFisher Scientific	11875093
Silk suture 13mm 5-0, P3, 45cm	Ethicon	JJ-640G
Sterile normal saline	ThermoFisher Scientific	TM4469
Sticky tape
Surgical board			A chopping board wrapped with autoclavable bag.
Surgical scissors	Proscitech	T104	Tip Dimensions (LxD): 38x7mm, Length 115mm
Suture forcep/ Curved Brophy forceps	Proscitech	T113C	Curved, Rounded narrow 2 mm tip, with serrations, length 165 mm
Suture needle holder (Olsen Hegar needle holder)	Proscitech	TC1322-180	length 190 mm, ratchet clamp
Syringe driver with foot pedal/ UMP3 Ultra micro pump	World Precision Instruments	UMP3-3
T75 tissue culture flask	ThermoFisher Scientific	156499
Thread
Trigene II surface disinfectant	Ceva
Trypan Blue and Cell Counting Chamber Slides	ThermoFisher Scientific	C10228
TrypLE Express dissociating medium	ThermoFisher Scientific	12605010