がん細胞の内頸動脈注射による脳転移のモデル化
Summary
脳転移は、癌患者の重度の罹患率と死亡率の原因です。ほとんどの脳転移マウスモデルは、死亡率および治療介入結果の交絡分析を混乱させる全身性転移によって複雑になります。ここに提示されるのは、最小限の全身腫瘍で一貫した頭蓋内腫瘍を生成する癌細胞の内部頸動脈注射のためのプロトコルです。
Abstract
脳転移は、癌患者の重度の罹患率と死亡率の原因です。複雑な神経微小環境や間質細胞相互作用などの転移性疾患の重要な側面は、 in vitro アッセイでは完全に再現できません。したがって、動物モデルは、治療的介入の効果を調査および理解するために重要です。しかし、ほとんどの脳腫瘍異種移植法は、時間枠と腫瘍量の点で一貫して脳転移を引き起こしません。がん細胞の心臓内注射によって生成された脳転移モデルは、意図しない頭蓋外腫瘍の負担をもたらし、非脳転移性の罹患率と死亡率につながる可能性があります。がん細胞の頭蓋内注射は頭蓋外腫瘍の形成を制限する可能性がありますが、注入された細胞が注射部位で特異な腫瘍塊を頻繁に形成する、軟髄膜の関与が高い、針刺し中の脳血管系の損傷など、いくつかの注意点があります。このプロトコルは、内頸動脈注射によって生成された脳転移のマウスモデルを記載する。この方法は、他の臓器を介さずに一貫して頭蓋内腫瘍を作製し、脳転移の治療薬の評価を可能にします。
Introduction
脳転移は、非常に予後不良に関連する一般的な悪性腫瘍です1,2。脳転移患者の標準治療はマルチモーダルであり、患者の一般的な健康状態、頭蓋外疾患の負担、および脳内の腫瘍の数と位置に応じて、脳神経外科、全脳放射線療法、および/または定位放射線手術で構成されます3,4。最大3つの頭蓋内病変を有する患者は外科的切除または定位放射線手術の対象となりますが、手術関連の感染および浮腫のリスクを回避するために、複数の病変を有する患者には全脳放射線療法が推奨されます5。しかし、全脳放射線療法は放射線感受性の脳構造に損傷を与え、生活の質の低下に寄与する可能性があります6。
全身療法は、複数の病変を持つ患者を治療するための非侵襲的な代替的かつ論理的なアプローチです7。しかし、血流を介した細胞傷害性薬物の受動的送達は安全でない毒性のリスクなしに脳内で治療レベルを達成できないため、全身療法の有効性が低いという長年の考えのために、あまり考慮されていません8。このパラダイムは、最近米国食品医薬品局(FDA)が承認した全身療法(転移性HER2+乳がん脳転移に適応されるトラスツズマブとカペシタビンを含むツカチニブ)9,10,11,12、および脳転移患者に対する全身療法オプションの検討を含む治療ガイドラインの更新によって変化し始めています13,14。
これに関連して、分子標的療法、免疫療法、および標的ナノ薬物キャリアなどの代替薬物送達システムの分野における開発は、脳転移治療の課題を潜在的に克服することができる15、16、17、18。さらに、脳腫瘍関門の透過処理を介して薬物送達を改善するための化学的および機械的アプローチも調査されています19,20。このようなアプローチを研究し、目的に合わせて最適化するには、脳転移の複雑な生理機能を反映するだけでなく、頭蓋内薬物反応の客観的な分析を可能にする前臨床モデルを使用することが重要です。
大まかに言えば、in vivoで脳転移をモデル化するための現在のアプローチには、マウスにおける癌細胞の心臓内(左心室)、静脈内(通常は尾静脈)、頭蓋内、または頸動脈内(総頸動脈)注射が含まれます21、22、23、24、25、26、27.腫瘍生着戦略とは別に、腫瘍抑制遺伝子の除去または癌遺伝子の活性化によって腫瘍形成が引き起こされる遺伝子改変マウスモデルは、腫瘍モデリングに有用である。しかし、二次腫瘍を産生することが報告されている遺伝子操作されたマウスモデルはごくわずかであり、脳転移を確実に産生するマウスモデルはさらに少ない28,29,30。
心臓内(左心室)および静脈内(通常は尾静脈)注射などの生着法は、癌の全身播種を模倣する。これらのモデルは通常、循環器系の「初回通過」中にほとんどの腫瘍細胞をトラップする毛細血管床に応じて、複数の臓器(脳、肺、肝臓、腎臓、脾臓など)に病変を引き起こします31。ただし、脳の生着率が一貫していない場合は、目的の統計的検出力のサンプルサイズを達成するために、より多くの動物が必要になります。これらの心臓内および静脈内注射法 によって 最終的に脳内に定着する腫瘍細胞の数はさまざまです。したがって、脳転移腫瘍の負荷は動物によって異なる可能性があり、進行の違いにより、実験のタイムラインと結果の解釈を標準化することが困難になる可能性があります。頭蓋外腫瘍の量は、脳以外の転移死亡率につながる可能性があり、これらのモデルは頭蓋内の有効性を評価するのに適していません。脳向性細胞株は、頭蓋外樹立を減少させるために人工クローン選択プロセスを用いて確立されているが、テイク率は一貫しておらず、クローン選択プロセスはヒト腫瘍に通常見られる不均一性を減少させることができる32。
頭蓋内および頸動脈内注射などの脳特異的生着法により、より一貫性のある効率的な脳転移モデリングが可能になります。頭蓋内法33では、癌細胞は典型的には前頭大脳皮質に注入され、これは低い全身的関与で迅速かつ再現性のある腫瘍伸長を生成する。この手順は死亡率が低く忍容性が高いが33、注意点は、脳内に細胞の(局所化された)ボーラスを迅速に導入し、早期脳転移の病因をモデル化しない比較的粗雑なアプローチであるということです。針は脳組織血管系を損傷し、それが局所的な炎症を引き起こします5,34。経験から、腫瘍細胞注入物は針の除去中に逆流する傾向があり、軟髄膜の関与につながります。あるいは、頸動脈内法は、脳微小血管系を最初に遭遇する毛細血管床として、循環、血管外漏出、およびコロニー形成における生存をモデル化して、細胞を総頸動脈に送達する24。他の25と一致して、この方法に関する私たちの経験は、外頸動脈を介してこれらの組織の毛細血管床に癌細胞が意図せずに送達されるため、顔面腫瘍を引き起こす可能性があることがわかりました(未発表データ)。総頚動脈注射の前に外頚動脈を結紮することで顔面腫瘍を予防することができます(図1)。記事の残りの部分では、この方法は「内頸動脈注射」と呼ばれます。経験から、内頸動脈注入法は、全身事象が非常に少ない脳転移を一貫して生成し、異なる原発癌(黒色腫、乳癌、肺癌など)の脳転移モデルを生成することに成功しています(図1)。欠点は、技術的に困難で、時間がかかり、侵襲的であり、細胞数とモニタリングタイムラインの慎重な最適化が必要であることです。要約すると、頭蓋内および内頸動脈注射法の両方が、脳腫瘍関連の生存利益に対する治療的影響を評価するのに適したマウスモデルを生成する。
このプロトコルは、全身的な関与がほとんどない脳転移のマウスモデルを作成するための内頸動脈注射法を説明しているため、薬物分布の前臨床評価と実験的治療法の有効性に適しています。
図1:脳転移のための内頸動脈注射プロトコルの概略図。 外頸動脈結紮を伴う内頚動脈注射は、様々な原発癌由来の脳転移モデルを確実に作製することができる。このプロトコルでは、3つの結紮糸が頸動脈に配置されています(図ではL1-L3と注釈されています)。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
Protocol
Representative Results
Discussion
脳転移は、がん細胞が原発部位から脳に広がる複雑なプロセスです。この多段階プロセスの特定の段階を反映したさまざまな動物モデルが利用可能であり、前臨床転移研究を設計するための生理学的および実用的な考慮事項があります41,42。脳転移治療のためのナノメディシンの使用を調査したほとんどの発表された研究は、心臓内43,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、オーストラリア国立保健医療研究評議会(NHMRC)、助成金番号APP1162560によって資金提供されました。MLは、UQ大学院研究奨学金によって資金提供されました。畜産と動物の 生体内 イメージングにご協力いただいた皆様に感謝いたします。この研究のためにジルコニウムのアリコートを寄付してくれたロイヤルブリスベンアンドウィメンズ病院に感謝します。
Materials
| 100µm cell strainer | Corning | CLS431752 | |
| 30G Microlance needle | BD | 23748 | |
| 31G Ultra-Fine II insulin syringe | BD | 326103 | |
| Angled forceps | Proscitech | T67A-SS | Fine pointed, angled without serrations, 18mm tip, length 128 mm |
| Animal heat mat | |||
| Antibiotic and antimycotic | ThermoFisher Scientific | 15240062 | |
| Autoclave bags | |||
| BT-474 (HTB-20) breast cancer cell line | ATCC | HTB-20 | |
| Buprenorphine (TEMGESIC) | |||
| Countess cell counter | ThermoFisher Scientific | C10227 | |
| Diet-76A | ClearH2O | 72-07-5022 | |
| Dissection microscope | |||
| Ear puncher | |||
| Electric clippers | |||
| Fine angled forceps | Proscitech | DEF11063-07 | Angled 45°, Tip smooth, Tip width: 0.4 mm, Tip dimension: 0.4 x 0.3 mm, length 9cm |
| Fine tubing for cannula, Tubing OD (in) 1/32, Tubing ID (in) 1/100in | Cole Parmer | EW-06419-00 | |
| Foetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | 26140079 | |
| Hank's Balanced Salt Solution without calcium and magnesium | ThermoFisher Scientific | 14170120 | |
| Hydrogel | ClearH2O | 70-01-5022 | |
| Isoflurane | |||
| Kimwipes Low lint disposable wipers | Kimberly Clark- Kimwipes | Z188964 | |
| Mashed mouse chow | |||
| Meloxicam (METACAM) | |||
| Nose cone | Fashioned out of a microfuge tube | ||
| PAA ocular lubricant (Carbomer 2mg/g) | Bausch and lomb | ||
| Povidone-iodine solution | Betadine | 2505692 | |
| PPE (glove, mask, gown, hairnet) | |||
| Retractors | Kent Scientific | SURGI-5001 | |
| RPMI 1640 Media | ThermoFisher Scientific | 11875093 | |
| Silk suture 13mm 5-0, P3, 45cm | Ethicon | JJ-640G | |
| Sterile normal saline | ThermoFisher Scientific | TM4469 | |
| Sticky tape | |||
| Surgical board | A chopping board wrapped with autoclavable bag. | ||
| Surgical scissors | Proscitech | T104 | Tip Dimensions (LxD): 38x7mm, Length 115mm |
| Suture forcep/ Curved Brophy forceps | Proscitech | T113C | Curved, Rounded narrow 2 mm tip, with serrations, length 165 mm |
| Suture needle holder (Olsen Hegar needle holder) | Proscitech | TC1322-180 | length 190 mm, ratchet clamp |
| Syringe driver with foot pedal/ UMP3 Ultra micro pump | World Precision Instruments | UMP3-3 | |
| T75 tissue culture flask | ThermoFisher Scientific | 156499 | |
| Thread | |||
| Trigene II surface disinfectant | Ceva | ||
| Trypan Blue and Cell Counting Chamber Slides | ThermoFisher Scientific | C10228 | |
| TrypLE Express dissociating medium | ThermoFisher Scientific | 12605010 |
References
- Nayak, L., Lee, E. Q., Wen, P. Y. Epidemiology of brain metastases. Current Oncology Reports. 14 (1), 48-54 (2012).
- . Australian Institute of Health and Welfare. Cancer in Australia. , (2017).
- Maher, E. A., Mietz, J., Arteaga, C. L., DePinho, R. A., Mohla, S. Brain metastasis: opportunities in basic and translational research. Cancer Research. 69 (15), 6015-6020 (2009).
- Lin, N. U. Breast cancer brain metastases: new directions in systemic therapy. Ecancermedicalscience. 7, (2013).
- Zimmer, A. S., Van Swearingen, A. E. D., Anders, C. K. HER2-positive breast cancer brain metastasis: A new and exciting landscape. Cancer Reports. 5 (4), (2020).
- Brown, P. D., et al. Postoperative stereotactic radiosurgery compared with whole brain radiotherapy for resected metastatic brain disease (NCCTG N107C/CEC·3): a multicentre, randomised, controlled, phase 3 trial. Lancet Oncology. 18 (8), 1049-1060 (2017).
- Murrell, J., Board, R. The use of systemic therapies for the treatment of brain metastases in metastatic melanoma: Opportunities and unanswered questions. Cancer Treatment Reviews. 39 (8), 833-838 (2013).
- Stemmler, H. J., et al. Ratio of trastuzumab levels in serum and cerebrospinal fluid is altered in HER2-positive breast cancer patients with brain metastases and impairment of blood-brain barrier. Anticancer Drugs. 18 (1), 23-28 (2007).
- Venur, V. A., Leone, J. P. Targeted therapies for brain metastases from breast cancer. International Journal of Molecular Sciences. 17 (9), 1543 (2016).
- Murthy, R., et al. Tucatinib with capecitabine and trastuzumab in advanced HER2-positive metastatic breast cancer with and without brain metastases: a non-randomised, open-label, phase 1b study. The Lancet Oncology. 19 (7), 880-888 (2018).
- Murthy, R. K., et al. trastuzumab, and capecitabine for HER2-positive metastatic breast cancer. New England Journal of Medicine. 382 (7), 597-609 (2019).
- Shah, M., et al. FDA approval summary: Tucatinib for the treatment of patients with advanced or metastatic HER2-positive breast cancer. Clinical Cancer Research. 27 (5), 1220-1226 (2021).
- Vogelbaum, M. A., et al. Treatment for brain metastases: ASCO-SNO-ASTRO guideline. Journal of Clinical Oncology. 40 (5), 492-516 (2021).
- Ramakrishna, N., et al. Management of advanced human epidermal growth factor receptor 2-positive breast cancer and brain metastases: ASCO guideline update. Journal of Clinical Oncology. 10, (2022).
- Li, J., et al. A multifunctional polymeric nanotheranostic system delivers doxorubicin and imaging agents across the blood-brain barrier targeting brain metastases of breast cancer. ACS Nano. 8 (10), 9925-9940 (2014).
- Mittapalli, R. K., et al. Paclitaxel-hyaluronic nanoconjugates prolong overall survival in a preclinical brain metastases of breast cancer model. Molecular Cancer Therapeutics. 12 (11), 2389-2399 (2013).
- Hamilton, A. M., et al. Nanoparticles coated with the tumor-penetrating peptide iRGD reduce experimental breast cancer metastasis in the brain. Journal of Molecular Medicine. 93 (9), 991-1001 (2015).
- Patil, R., et al. MRI virtual biopsy and treatment of brain metastatic tumors with targeted nanobioconjugates: nanoclinic in the brain. ACS Nano. 9 (5), 5594-5608 (2015).
- Brighi, C., et al. MR-guided focused ultrasound increases antibody delivery to non-enhancing high-grade glioma. Neuro-Oncology Advances. 2 (1), (2020).
- Inamura, T., Black, K. L. Bradykinin selectively opens blood-tumor barrier in experimental brain tumors. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 14 (5), 862-870 (1994).
- Priego, N., et al. Abstract 2746: Stat3 labels a subpopulation of reactive astrocytes required for brain metastasis. Cancer Research. 79, 2746 (2019).
- Wyatt, E. A., Davis, M. E. Method of establishing breast cancer brain metastases affects brain uptake and efficacy of targeted, therapeutic nanoparticles. Bioengineering & Translational Medicine. 4 (1), 30-37 (2018).
- Nakayama, J., et al. The in vivo selection method in breast cancer metastasis. International Journal of Molecular Sciences. 22 (4), 1886 (2021).
- Zhang, C., Lowery, F. J., Yu, D. Intracarotid cancer cell injection to produce mouse models of brain metastasis. Journal of Visualized Experiments. 120, 55085 (2017).
- Liu, Z., et al. Improving orthotopic mouse models of patient-derived breast cancer brain metastases by a modified intracarotid injection method. Scientific Reports. 9 (1), 622 (2019).
- Bos, P. D., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to the brain. Nature. 459, 1005-1009 (2009).
- Hu, X., Villodre, E. S., Woodward, W. A., Debeb, B. G. Modeling brain metastasis via tail-vein injection of inflammatory breast cancer cells. Journal of Visualized Experiments. 168, (2021).
- Cho, J. H., et al. AKT1 activation promotes development of melanoma metastases. Cell Reports. 13 (5), 898-905 (2015).
- Meuwissen, R., et al. Induction of small cell lung cancer by somatic inactivation of both Trp53 and Rb1 in a conditional mouse model. Cancer Cell. 4 (3), 181-189 (2003).
- Kato, M., et al. Transgenic mouse model for skin malignant melanoma. Oncogene. 17 (14), 1885-1888 (1998).
- Khanna, C., Hunter, K. Modeling metastasis in vivo. Carcinogenesis. 26 (3), 513-523 (2005).
- Sulaiman, A., Wang, L. Bridging the divide: preclinical research discrepancies between triple-negative breast cancer cell lines and patient tumors. Oncotarget. 8 (68), 113269-113281 (2017).
- Pierce, A. M., Keating, A. K. Creating anatomically accurate and reproducible intracranial xenografts of human brain tumors. Journal of Visualized Experiments. 91, 52017 (2014).
- Geisler, J. A., et al. Modeling brain metastases through intracranial injection and magnetic resonance imaging. Journal of Visualized Experiments. 160, (2020).
- Reid, Y., Storts, D., Riss, T., Minor, L., et al. . in Assay Guidance Manual. eds Markossian, S. et al.) Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences. , (2004).
- Janowicz, P. W., et al. Understanding nanomedicine treatment in an aggressive spontaneous brain cancer model at the stage of early blood brain barrier disruption. Biomaterials. , 283 (2022).
- Houston, Z. H., et al. Understanding the Uptake of Nanomedicines at Different Stages of Brain Cancer Using a Modular Nanocarrier Platform and Precision Bispecific Antibodies. ACS Cent Sci. 6 (5), 727-738 (2020).
- Matsumura, Y., Maeda, H. A new concept for macromolecular therapeutics in cancer chemotherapy: mechanism of tumoritropic accumulation of proteins and the antitumor agent smancs. Cancer Research. 46, 6387-6392 (1986).
- Clemons, T. D., et al. Distinction between active and passive targeting of nanoparticles dictate their overall therapeutic efficacy. Langmuir. 34 (50), 15343-15349 (2018).
- Wu, J., et al. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. Bio-Protocol. 11 (5), (2021).
- Masmudi-Martín, M., et al. Brain metastasis models: What should we aim to achieve better treatments. Advanced Drug Delivery Reviews. 169 (20), 79-99 (2021).
- Carney, C. P., et al. Harnessing nanomedicine for enhanced immunotherapy for breast cancer brain metastases. Drug Delivery and Translational Research. 11 (6), 2344-2370 (2021).
- Hamilton, A. M., et al. Nanoparticles coated with the tumor-penetrating peptide iRGD reduce experimental breast cancer metastasis in the brain. Journal of Molecular Medicine. 93 (9), 991-1001 (2015).
- Bao, Y., et al. Synergistic chemotherapy for breast cancer and breast cancer brain metastases via paclitaxel-loaded oleanolic acid nanoparticles. Molecular Pharmaceutics. 17 (4), 1343-1351 (2020).
- Kotb, S., et al. Gadolinium-based nanoparticles and radiation therapy for multiple brain melanoma metastases: Proof of concept before phase I trial. Theranostics. 6 (3), 418-427 (2016).
- Zhang, T., et al. Multitargeted nanoparticles deliver synergistic drugs across the blood-brain barrier to brain metastases of triple negative breast cancer cells and tumor-associated macrophages. Advanced Healthcare Materials. 8 (18), 1900543 (2019).
- He, C., et al. Blood-brain barrier-penetrating amphiphilic polymer nanoparticles deliver docetaxel for the treatment of brain metastases of triple negative breast cancer. Journal of Controlled Release. 246, 98-109 (2017).
- Wang, X., et al. Enhanced anti-brain metastasis from non-small cell lung cancer of osimertinib and doxorubicin co-delivery targeted nanocarrier. International Journal of Nanomedicine. 15, 5491-5501 (2020).
- Gries, M., et al. Multiscale selectivity and in vivo biodistribution of NRP-1-targeted theranostic AGuIX nanoparticles for PDT of glioblastoma. International Journal of Nanomedicine. 15, 8739-8758 (2020).
