Mevcut protokol, temsili EV’leri (eksozomlar ve mikro-parçacıklar) kültürlü insan MSC’lerinden izole etmek ve karakterize etmek için diferansiyel santrifüjlemeyi açıklamaktadır. Bu EV’lerin diğer uygulamaları da bu makalede açıklanmaktadır.
Hücre dışı veziküller (EV’ler), çoğu hücre tipi tarafından salınan heterojen membran nanopartikülleridir ve organizma homeostazının fizyolojik düzenleyicileri ve patolojilerin önemli göstergeleri olarak giderek daha fazla tanınmaktadır; Bu arada, erişilebilir ve kontrol edilebilir hastalık terapötikleri oluşturmak için muazzam potansiyelleri ortaya çıkmaktadır. Mezenkimal kök hücreler (MSC’ler), etkili doku rejenerasyonunu hızlandırma ve iyi ölçeklenebilirlik ve tekrarlanabilirlik ile kapsamlı terapötik uygulamaları kolaylaştırma sözü veren kültürde büyük miktarda EV’yi serbest bırakabilir. MSC-EV’lerin toplanması ve uygulanması için basit ve etkili protokollere yönelik artan bir talep vardır. Burada, temsili EV’leri kültürlü insan MSC’lerinden, eksozomlardan ve mikro-parçacıklardan izole etmek ve karakterize etmek için diferansiyel santrifüjlemeye dayanan ayrıntılı bir protokol sağlanmıştır. Bu yöntemin uyarlanabilirliği, etiketleme, lokal transplantasyon ve sistemik enjeksiyon gibi bir dizi aşağı akış yaklaşımı için gösterilmiştir. Bu prosedürün uygulanması, translasyonel araştırmalarda basit ve güvenilir MSC-EV’lerin toplanması ve uygulanması ihtiyacını ele alacaktır.
Kök hücreler kendini yenileme yeteneğine ve translasyonel potansiyele sahip farklılaşmamış pluripotent hücrelerdir1. Mezenkimal kök hücreler (MSC’ler) laboratuvarda kolayca izole edilir, kültürlenir, genişletilir ve saflaştırılır, bu da çoklu geçişlerden sonra kök hücrelerin karakteristiği olarak kalır. Son yıllarda, artan kanıtlar, MSC’lerin terapötik kullanımda parakrin modda hareket ettiği görüşünü desteklemektedir 2,3. Özellikle hücre dışı veziküllerin (EV) salgılanması, MSC’lerin biyolojik fonksiyonlarına aracılık etmede çok önemli bir rol oynamaktadır. Çoğu hücre tipinden salınan heterojen membranöz nanopartiküller olarak, EV’ler eksozomlar (Exos), mikro-parçacıklar (MV’ler) ve hatta daha büyük apoptotik cisimler 4,5 olarak adlandırılan alt kategorilerden oluşur. Bunlar arasında Exos, endozomal kökenli ve fizyolojik koşullarda aktif olarak salgılanan 40-150 nm büyüklüğünde en çok çalışılan EV’dir. MV’ler, yüksek fosfatidilserin ekspresyonu ve donör hücrelerin yüzey belirteçlerinin ekspresyonu ile karakterize edilen 100-1.000 nm çapında hücre plazma zarının yüzeyinden doğrudan dökülerek oluşturulur6. EV’ler, ana hücrelere benzer işlevlere sahip olan ve hücre iletişimi, bağışıklık tepkisi ve doku hasarı onarımında önemli bir rol oynayan RNA, proteinler ve diğer biyoaktif molekülleri içerir7. MSC-EV’ler, rejeneratif tıpta güçlü bir hücresiz terapötik araç olarak geniş çapta araştırılmıştır8.
MSC kaynaklı EV’lerin izolasyonu ve saflaştırılması, araştırma ve uygulama alanında yaygın bir konudur. Günümüzde, diferansiyel ve yoğunluk gradyanı ultrasantrifüjleme9, ultrafiltrasyon işlemi 10, immünomanyetik ayırma 11, moleküler dışlama kromatografı12 ve mikroakışkan çip13, EV’lerin izolasyonunda ve saflaştırılmasında yaygın olarak kullanılan yöntemlerdir. Her yaklaşımın avantajları ve dezavantajları ile, toplanan EV’lerin miktarı, saflığı ve aktivitesi aynı anda karşılanamaz14,15. Bu çalışmada, EV’lerin kültürlü MSC’lerden izolasyonu ve karakterizasyonunun diferansiyel santrifüjleme protokolü ayrıntılı olarak gösterilmiş olup, etkin terapötik kullanımı desteklemiştir 16,17,18,19,20. Bu yöntemin floresan etiketleme, lokal transplantasyon ve sistemik enjeksiyon gibi bir dizi aşağı akış yaklaşımına uyarlanabilirliği daha da örneklenmiştir. Bu prosedürün uygulanması, MSC-EV’lerin çeviri araştırmalarında basit ve güvenilir bir şekilde toplanması ve uygulanması ihtiyacını ele alacaktır.
EV’ler, antijen sunumu, genetik materyal taşınması, hücre mikroçevre modifikasyonu ve diğerleri dahil olmak üzere çeşitli biyolojik aktivitelerde önemli bir rol oynamak için ortaya çıkmaktadır. Ayrıca, geniş uygulamaları hastalıkların teşhisi ve tedavisi için yeni yaklaşımlar ve fırsatlar getirmektedir21. EV’lerin terapötik uygulamalarının uygulanması, başarılı izolasyon ve karakterizasyona dayanmaktadır. Bununla birlikte, standartlaştırılmış izolasyon ve safla…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (32000974, 81930025 ve 82170988) ve Çin Doktora Sonrası Bilim Vakfı (2019M663986 ve BX20190380) tarafından verilen hibelerle desteklenmiştir. Temel Tıp Ulusal Deneysel Öğretim Gösteri Merkezi (AMFU) ve Hava Kuvvetleri Tıp Üniversitesi Askeri Tıbbi İnovasyon Merkezi Analitik ve Test Merkez Laboratuvarı’nın yardımları için minnettarız.
10% povidone-iodine (Betadine) | Weizhenyuan | 10053956954292 | Wound disinfection |
Calibration solution | Particle Metrix | 110-0020 | Calibrate the NTA instrument |
Carprofen | Sigma | 53716-49-7 | Analgesic medicine |
Caudal vein imager | KEW Life Science | KW-XXY | Caudal vein imager |
Centrifuge | Eppendorf | 5418R | Centrifugation |
Fatal bovine serum | Corning | 35-081-CV | Culture of UCMSCs |
Formvar/carbon-coated square mesh | PBL Assay Science | 24916-25 | Transmission electron microscope |
Heating pad | Zhongke Life Science | Z8G5JBMz | Post-treatment care of animals |
Heparin Solution | StemCell | 7980 | Systemic injection |
Isoflurane | RWD Life Science | R510-22 | Animal anesthesia |
Minimum Essential Medium Alpha basic (1x) | Gibco | C12571500BT | Culture of UCMSCs |
Nanoparticle tracking analyzer | Particle Metrix | ZetaView PMX120 | Nanoparticle tracking analysis |
PBS (1x) | Meilunbio | MA0015 | Resuspend EVs |
Penicillin/Streptomycin | Procell Life Science | PB180120 | Culture of UCMSCs |
Phosphotungstic acid | Solarbio | 12501-23-4 | Transmission electron microscope |
Pipette | Eppendorf | 3120000224 | |
PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit | Sigma-Aldrich | MINI26 | Labeling EVs |
Skin biopsy punch | Acuderm | 69038-10-50 | Skin defects |
Software ZetaView | Particle Metrix | Version 8.05.14 SP7 | |
Thermostatic equipment | Grant | v-0001-0005 | Water bath |
Transmission electron microscope | HITACHI | HT7800 | Transmission electron microscope |
UCMSCs | Bai'ao | UKK220201 | Commercially UCMSCs |
Ultracentrifuge | Beckman | XPN-100 | Centrifugation |
Ultrapure filtered water purification system | Milli-Q | IQ 7000 | Preparation of ultrapure water |