Dit protocol beschrijft de differentiële centrifugatie voor het isoleren en karakteriseren van representatieve EV’s (exosomen en microvesicles) uit gekweekte menselijke MSC’s. Verdere toepassingen van deze EV’s worden in dit artikel ook toegelicht.
Extracellulaire blaasjes (EV’s) zijn heterogene membraannanodeeltjes die door de meeste celtypen worden vrijgegeven en ze worden steeds meer erkend als fysiologische regulatoren van organismale homeostase en belangrijke indicatoren van pathologieën; In de tussentijd ontstaat hun immense potentieel om toegankelijke en controleerbare ziektetherapieën op te zetten. Mesenchymale stamcellen (MSC’s) kunnen grote hoeveelheden EV’s in cultuur vrijgeven, die veelbelovend zijn gebleken om effectieve weefselregeneratie op gang te brengen en uitgebreide therapeutische toepassingen met goede schaalbaarheid en reproduceerbaarheid mogelijk te maken. Er is een groeiende vraag naar eenvoudige en effectieve protocollen voor het verzamelen en toepassen van MSC-EV’s. Hier wordt een gedetailleerd protocol geleverd op basis van differentiële centrifugatie om representatieve EV’s te isoleren en te karakteriseren uit gekweekte menselijke MSC’s, exosomen en microvesicles voor verdere toepassingen. Het aanpassingsvermogen van deze methode wordt aangetoond voor een reeks downstream-benaderingen, zoals etikettering, lokale transplantatie en systemische injectie. De implementatie van deze procedure zal tegemoetkomen aan de behoefte aan eenvoudige en betrouwbare MSC-EV’s die worden verzameld en toegepast in translationeel onderzoek.
Stamcellen zijn ongedifferentieerde pluripotente cellen met zelfvernieuwingsvermogen en translatiepotentieel1. Mesenchymale stamcellen (MSC’s) worden gemakkelijk geïsoleerd, gekweekt, uitgebreid en gezuiverd in het laboratorium, wat kenmerkend blijft voor stamcellen na meerdere passages. In de afgelopen jaren is er steeds meer bewijs dat de opvatting ondersteunt dat MSC’s in een paracriene modus werken bij therapeutisch gebruik 2,3. Vooral de afscheiding van extracellulaire blaasjes (EV’s) speelt een cruciale rol bij het bemiddelen van de biologische functies van MSC’s. Als heterogene vliezige nanodeeltjes die vrijkomen uit de meeste celtypen, bestaan EV’s uit subcategorieën die exosomen (Exos), microvesicles (MV’s) en nog grotere apoptotische lichamenworden genoemd 4,5. Onder hen is Exos de meest bestudeerde EV met een grootte van 40-150 nm, die van endosomale oorsprong is en actief wordt uitgescheiden in fysiologische omstandigheden. MV’s worden gevormd door rechtstreeks van het oppervlak van het celplasmamembraan af te stoten met een diameter van 100-1.000 nm, die worden gekenmerkt door een hoge expressie van fosfatidylserine en expressie van oppervlaktemarkers van donorcellen6. EV’s bevatten RNA, eiwitten en andere bioactieve moleculen, die vergelijkbare functies hebben als de oudercellen en een belangrijke rol spelen bij celcommunicatie, immuunrespons en herstel van weefselschade7. MSC-EV’s zijn op grote schaal onderzocht als een krachtig celvrij therapeutisch hulpmiddel in regeneratieve geneeskunde8.
Isolatie en zuivering van MSC-afgeleide EV’s is een veel voorkomend probleem op het gebied van onderzoek en toepassing. Op dit moment zijn differentiële en dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie9, ultrafiltratieproces 10, immunomagnetische scheiding11, moleculaire uitsluitingschromatograaf 12 en microfluïdische chip13 veelgebruikte methoden bij de isolatie en zuivering van EV’s. Met de voor- en nadelen van elke aanpak kan niet tegelijkertijd worden voldaan aan de hoeveelheid, zuiverheid en activiteit van ingezamelde EV’s14,15. In de huidige studie wordt het differentiële centrifugatieprotocol van isolatie en karakterisering van EV’s uit gekweekte MSC’s in detail getoond, wat efficiënt therapeutisch gebruik heeft ondersteund 16,17,18,19,20. Het aanpassingsvermogen van deze methode voor een reeks downstream-benaderingen, zoals fluorescerende etikettering, lokale transplantatie en systemische injectie, is verder geïllustreerd. De implementatie van deze procedure zal tegemoetkomen aan de behoefte aan eenvoudige en betrouwbare verzameling en toepassing van MSC-EV’s in translationeel onderzoek.
EV’s zijn in opkomst om een belangrijke rol te spelen in diverse biologische activiteiten, waaronder antigeenpresentatie, genetisch materiaaltransport, celmicro-omgevingsmodificatie en andere. Bovendien brengt hun brede toepassing nieuwe benaderingen en mogelijkheden voor het diagnosticeren en behandelen van ziekten21. Implementatie van therapeutische toepassingen van EV’s is gebaseerd op succesvolle isolatie en karakterisering. Vanwege het gebrek aan gestandaardiseerde isolatie- en zuiveringsmeth…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Natural Science Foundation of China (32000974, 81930025 en 82170988) en de China Postdoctoral Science Foundation (2019M663986 en BX20190380). We zijn dankbaar voor de hulp van het National Experimental Teaching Demonstration Center for Basic Medicine (AMFU) en het Analytical and Testing Central Laboratory of Military Medical Innovation Center van de Air Force Medical University.
10% povidone-iodine (Betadine) | Weizhenyuan | 10053956954292 | Wound disinfection |
Calibration solution | Particle Metrix | 110-0020 | Calibrate the NTA instrument |
Carprofen | Sigma | 53716-49-7 | Analgesic medicine |
Caudal vein imager | KEW Life Science | KW-XXY | Caudal vein imager |
Centrifuge | Eppendorf | 5418R | Centrifugation |
Fatal bovine serum | Corning | 35-081-CV | Culture of UCMSCs |
Formvar/carbon-coated square mesh | PBL Assay Science | 24916-25 | Transmission electron microscope |
Heating pad | Zhongke Life Science | Z8G5JBMz | Post-treatment care of animals |
Heparin Solution | StemCell | 7980 | Systemic injection |
Isoflurane | RWD Life Science | R510-22 | Animal anesthesia |
Minimum Essential Medium Alpha basic (1x) | Gibco | C12571500BT | Culture of UCMSCs |
Nanoparticle tracking analyzer | Particle Metrix | ZetaView PMX120 | Nanoparticle tracking analysis |
PBS (1x) | Meilunbio | MA0015 | Resuspend EVs |
Penicillin/Streptomycin | Procell Life Science | PB180120 | Culture of UCMSCs |
Phosphotungstic acid | Solarbio | 12501-23-4 | Transmission electron microscope |
Pipette | Eppendorf | 3120000224 | |
PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit | Sigma-Aldrich | MINI26 | Labeling EVs |
Skin biopsy punch | Acuderm | 69038-10-50 | Skin defects |
Software ZetaView | Particle Metrix | Version 8.05.14 SP7 | |
Thermostatic equipment | Grant | v-0001-0005 | Water bath |
Transmission electron microscope | HITACHI | HT7800 | Transmission electron microscope |
UCMSCs | Bai'ao | UKK220201 | Commercially UCMSCs |
Ultracentrifuge | Beckman | XPN-100 | Centrifugation |
Ultrapure filtered water purification system | Milli-Q | IQ 7000 | Preparation of ultrapure water |