הפרוטוקול הנוכחי מתאר את הצנטריפוגה הדיפרנציאלית לבידוד ואפיון כלי רכב חשמליים מייצגים (אקסוזומים ומיקרובוסיקלים) מתאי MSC אנושיים מתורבתים. יישומים נוספים של כלי רכב חשמליים אלה מוסברים גם במאמר זה.
שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) הן ננו-חלקיקי קרום הטרוגניים המשוחררים על ידי רוב סוגי התאים, והם מוכרים יותר ויותר כרגולטורים פיזיולוגיים של הומאוסטזיס אורגניזם ואינדיקטורים חשובים לפתולוגיות; בינתיים, הפוטנציאל העצום שלהם לבסס טיפולים נגישים וניתנים לשליטה במחלות הולך וגדל. תאי גזע מזנכימליים (MSCs) יכולים לשחרר כמויות גדולות של כלי רכב חשמליים בתרבית, אשר הראו הבטחה להתניע התחדשות רקמות יעילה ולהקל על יישומים טיפוליים נרחבים עם מדרגיות טובה ויכולת שחזור. קיים ביקוש גובר לפרוטוקולים פשוטים ויעילים לאיסוף ויישום MSC-EVs. כאן, פרוטוקול מפורט מסופק המבוסס על צנטריפוגה דיפרנציאלית כדי לבודד ולאפיין כלי רכב חשמליים מייצגים מתאי MSC אנושיים מתורבתים, אקסוזומים ומיקרו-שלפוחיות ליישומים נוספים. יכולת ההסתגלות של שיטה זו מוצגת עבור סדרה של גישות במורד הזרם, כגון תיוג, השתלה מקומית והזרקה מערכתית. יישום נוהל זה ייתן מענה לצורך באיסוף ויישום פשוט ואמין של MSC-EVs במחקר תרגומי.
תאי גזע הם תאים פלוריפוטנטיים בלתי ממוינים בעלי יכולת התחדשות עצמית ופוטנציאל תרגום1. תאי גזע מזנכימליים (MSCs) מבודדים, מתורבתים, מורחבים ומטוהרים בקלות במעבדה, מה שנשאר אופייני לתאי גזע לאחר מעברים מרובים. בשנים האחרונות, עדויות הולכות וגדלות תומכות בדעה כי MSCs לפעול במצב paracrine בשימוש טיפולי 2,3. במיוחד הפרשת שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) ממלאת תפקיד מכריע בתיווך הפונקציות הביולוגיות של MSCs. כננו-חלקיקים קרומיים הטרוגניים המשתחררים מרוב סוגי התאים, כלי רכב חשמליים מורכבים מתת-קטגוריות הנקראות אקסוזומים (Exos), מיקרו-שלפוחיות (MVs), וגופים אפופטוטיים גדולים עוד יותר 4,5. ביניהם, Exos הוא EV הנחקר ביותר עם גודל של 40-150 ננומטר, שהוא ממוצא אנדוזומלי מופרש באופן פעיל בתנאים פיזיולוגיים. MVs נוצרים על ידי שפיכה ישירות מפני השטח של קרום פלזמה התא בקוטר של 100-1,000 ננומטר, אשר מאופיינים ביטוי גבוה של פוספטידיל סרין ביטוי של סמנים פני השטח של תאים תורמים6. כלי רכב חשמליים מכילים רנ”א, חלבונים ומולקולות ביו-אקטיביות אחרות, שיש להן תפקידים דומים לתאי האב וממלאות תפקיד משמעותי בתקשורת התא, בתגובה החיסונית ובתיקון נזק לרקמות7. MSC-EVs נחקרו באופן נרחב ככלי טיפולי רב עוצמה ללא תאים ברפואה רגנרטיבית8.
בידוד וטיהור של כלי רכב חשמליים שמקורם ב-MSC הוא נושא נפוץ בתחום המחקר והיישום. כיום, אולטרה-צנטריפוגה דיפרנציאלית וצפיפות שיפוע9, תהליך אולטרה-סינון 10, הפרדה אימונומגנטית 11, כרומטוגרף הדרה מולקולרית12 ושבב מיקרופלואידי13 הן שיטות בשימוש נרחב בבידוד וטיהור של כלי רכב חשמליים. עם היתרונות והחסרונות של כל גישה, לא ניתן לספק את הכמות, הטוהר והפעילות של כלי רכב חשמליים שנאספו בו זמנית14,15. במחקר הנוכחי מוצג בפירוט פרוטוקול הצנטריפוגה הדיפרנציאלית של בידוד ואפיון של כלי רכב חשמליים מתאי MSC מתורבתים, אשר תמך בשימוש טיפולי יעיל 16,17,18,19,20. יכולת ההסתגלות של שיטה זו לסדרה של גישות במורד הזרם, כגון תיוג פלואורסצנטי, השתלה מקומית והזרקה מערכתית, הוכחה עוד יותר. יישום נוהל זה ייתן מענה לצורך באיסוף ויישום פשוט ואמין של MSC-EV במחקר תרגומי.
כלי רכב חשמליים ממלאים תפקיד חשוב בפעילויות ביולוגיות מגוונות, כולל הצגת אנטיגן, הובלת חומרים גנטיים, שינוי מיקרו-סביבה של תאים ועוד. יתר על כן, היישום הרחב שלהם מביא גישות חדשות והזדמנויות לאבחון וטיפול במחלות21. יישום יישומים טיפוליים של כלי רכב חשמליים מבוסס על בידוד ואפיון…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (32000974, 81930025 ו-82170988) ומהקרן הסינית למדע פוסט-דוקטורט (2019M663986 ו-BX20190380). אנו אסירי תודה על הסיוע של המרכז הלאומי להדגמת הוראה ניסויית לרפואה בסיסית (AMFU) והמעבדה המרכזית לניתוח ובדיקות של המרכז לחדשנות רפואית צבאית של האוניברסיטה הרפואית של חיל האוויר.
10% povidone-iodine (Betadine) | Weizhenyuan | 10053956954292 | Wound disinfection |
Calibration solution | Particle Metrix | 110-0020 | Calibrate the NTA instrument |
Carprofen | Sigma | 53716-49-7 | Analgesic medicine |
Caudal vein imager | KEW Life Science | KW-XXY | Caudal vein imager |
Centrifuge | Eppendorf | 5418R | Centrifugation |
Fatal bovine serum | Corning | 35-081-CV | Culture of UCMSCs |
Formvar/carbon-coated square mesh | PBL Assay Science | 24916-25 | Transmission electron microscope |
Heating pad | Zhongke Life Science | Z8G5JBMz | Post-treatment care of animals |
Heparin Solution | StemCell | 7980 | Systemic injection |
Isoflurane | RWD Life Science | R510-22 | Animal anesthesia |
Minimum Essential Medium Alpha basic (1x) | Gibco | C12571500BT | Culture of UCMSCs |
Nanoparticle tracking analyzer | Particle Metrix | ZetaView PMX120 | Nanoparticle tracking analysis |
PBS (1x) | Meilunbio | MA0015 | Resuspend EVs |
Penicillin/Streptomycin | Procell Life Science | PB180120 | Culture of UCMSCs |
Phosphotungstic acid | Solarbio | 12501-23-4 | Transmission electron microscope |
Pipette | Eppendorf | 3120000224 | |
PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit | Sigma-Aldrich | MINI26 | Labeling EVs |
Skin biopsy punch | Acuderm | 69038-10-50 | Skin defects |
Software ZetaView | Particle Metrix | Version 8.05.14 SP7 | |
Thermostatic equipment | Grant | v-0001-0005 | Water bath |
Transmission electron microscope | HITACHI | HT7800 | Transmission electron microscope |
UCMSCs | Bai'ao | UKK220201 | Commercially UCMSCs |
Ultracentrifuge | Beckman | XPN-100 | Centrifugation |
Ultrapure filtered water purification system | Milli-Q | IQ 7000 | Preparation of ultrapure water |