下流循環フリーDNAアプリケーションのための標準化されたリキッドバイオプシー前分析プロトコル

Summary

リキッドバイオプシーは、腫瘍学のトランスレーショナル研究へのアプローチに革命をもたらし、サンプルの収集、品質、および保管は、臨床応用を成功させるための重要なステップです。ここでは、ほとんどのトランスレーショナルリサーチラボで適用できる、下流の循環のないDNAアプリケーションのための標準化され検証されたプロトコルについて説明します。

Abstract

リキッドバイオプシー(LB)という用語は、原発性および/または転移性腫瘍に由来する血液および他の体液中のタンパク質、DNA、RNA、細胞、または細胞外小胞などの分子を指す。LBはトランスレーショナルリサーチの柱として浮上し、臨床腫瘍学の実践の一部となり始めており、固形生検に代わる低侵襲の代替手段を提供しています。LBは、血液などの低侵襲サンプル抽出 を介して 腫瘍のリアルタイムモニタリングを可能にします。これらのアプリケーションには、がんの早期発見、疾患進行の検出のための患者フォローアップ、最小限の残存疾患の評価、分子進行および耐性のメカニズムの潜在的な同定が含まれる。診療所で報告できるこれらのサンプルの信頼性の高い分析を達成するためには、分析前の手順を慎重に検討し、厳密に従う必要があります。サンプルの収集、品質、および保管は、ダウンストリームアプリケーションでの有用性を判断する重要なステップです。ここでは、循環のないDNAに基づく下流のリキッドバイオプシー分析のために、血漿および血清サンプルを収集、処理、および保存するための当社のリキッドバイオプシー作業モジュールからの標準化されたプロトコルを紹介します。ここで紹介するプロトコルは、標準的な機器を必要とし、生物学的手順に焦点を当てたほとんどの研究室に適用するのに十分な柔軟性があります。

Introduction

用語「リキッドバイオプシー」は、2010年¹ 月に、原発腫瘍に由来する血液および他の体液中の分子(例えば、タンパク質、デオキシリボ核酸(DNA)、リボ核酸(RNA))、細胞、または細胞外小胞(例えば、エキソソーム)の存在として定義された。リキッドバイオプシーサンプルの使用は、組織生検としてのトランスレーショナル腫瘍学研究に革命をもたらしており、特定の瞬間に特定の領域に限定され、腫瘍の不均一性のために関連するクローンを見逃す可能性がある。さらに、リキッドバイオプシーは、侵襲的な生検を回避し、患者のコストとリスクを軽減する可能性があるため、一次組織が乏しい、またはアクセスできない腫瘍タイプにおいて適切な役割を果たします。さらに、腫瘍分子特性は、主に治療圧力のために絶えず進化しており、リキッドバイオプシーサンプルは、ベースライン、治療、最良の応答、および疾患の進行時またはそれ以前など、疾患のさまざまな臨床的および治療的時間において、縦方向に採取することができるため、腫瘍クローンダイナミクスを捕捉することができる。「リアルタイムリキッドバイオプシー」の概念は、腫瘍の動的変化をリアルタイムで監視できることを意味し、この疾患における精密医療を可能にする。リキッドバイオプシーは、がんのスクリーニングと早期発見、疾患のリアルタイムモニタリング、最小限の残存疾患の検出、治療抵抗性のメカニズムの研究、治療レベル¹での患者の層別化など、診療所で数多くの潜在的な用途があります。疾患の再発および進行の早期発見は、多くの腫瘍タイプにおいて満たされていない臨床的ニーズであり、がん患者の生存率および生活の質を高める上で重要な要素である。日常的な画像化モダリティおよび可溶性腫瘍マーカーは、このタスクに必要な感度および/または特異性を欠いている可能性がある。したがって、循環遊離核酸に基づくものなど、診療所において新規な予測マーカーが緊急に必要とされている。

リキッドバイオプシー研究に使用されるサンプルの種類には、血液、尿、唾液、および便サンプルが含まれますが、これらに限定されません。他の腫瘍特異的試料は、細胞吸引液、脳脊髄液、胸水、嚢胞液および腹水、喀痰、および膵液²であり得る。前者の液体は、異なるタイプの癌由来物質、循環腫瘍細胞(CTC)、またはエキソソームおよび無細胞循環腫瘍DNA(ctDNA)などの断片を含んでもよい。核酸は、細胞外小胞(EV)に封入されるか、または細胞死および損傷のために体液中に放出され得る。循環遊離DNA(cfDNA)は、主にアポトーシス細胞または壊死細胞から血流に放出され、すべての個体に存在し、炎症性または腫瘍学的疾患におけるレベルの増加を示す³。エキソソームは、核酸、タンパク質、および脂質を含む細胞によって分泌される小さな細胞外小胞(〜30〜150nm)である。これらの小胞は、細胞間通信ネットワークの一部を形成し、多くの種類の体液2に一般的に^{見られる。}EV内部に封入された核酸は、体液中の過酷な環境から保護されているため、リキッドバイオプシー環境でこれらの分子を研究するためのより堅牢な方法を提供します。

全体として、リキッドバイオプシーサンプル中の循環核酸のレベルは非常に低いため、デジタルPCRや次世代シーケンシング(NGS)などの検出には高感度な方法が必要です。サンプルの事前分析管理は、血球溶解および無傷のDNAの放出を防ぎ、cfDNAとゲノムDNAの汚染を引き起こすために不可欠です。さらに、サンプルを抽出する際には、酵素ベースの分析方法の阻害剤の存在を避けるために注意する必要があります。

ここでは、循環核酸分析を含むリキッドバイオプシーベースの下流アプリケーションにとって重要な最初のステップである、血漿および血清サンプルの収集と保存のための標準化された方法を紹介します。

Protocol

血液サンプルの抽出前に、参加センターから事前の倫理的承認が得られました。血清および血漿単離のための以下のプロトコールは、生物医学研究のための倫理的原則に従って実施された。 メモ: プロトコルを開始する前の事前の考慮事項については、こちらを参照してください。生物医学研究におけるヒトサンプルの使用には、対応するインフォームドコンセントとと…

Representative Results

抗凝固剤を含まない血液チューブの遠心分離後、上相は淡黄色で表示され、血清画分に相当する(図2)。この画分は慎重に除去され、その後の分析のために小分けされます。 溶血は血漿または血清画分のいずれかに存在することができ、上相は赤みを帯びた外観を有し、これは溶血の存在および程度を示す(図3)。 <p class="jove_…

Discussion

リキッドバイオプシーは、癌の管理中の異なる時期に多数の潜在的な用途を有する。第一に、診断時に、臨床的にさらに調査される可能性のある潜在的な腫瘍病変の存在を示唆する腫瘍分子マーカーを同定する。第二に、治療中に疾患のリアルタイムモニタリング、治療分子応答の評価、クローン進化、および疾患再発または治療抵抗性の早期発見を行う。最後に、外科的処置の後、最小限?…

Materials

1.5 mL Eppendorf tubes	Eppendorf	0030 120.086	Any standard tubes/equipment can be used
10 mL serological disposable pipettes	BIOFIL	GSP010010	Any standard tubes/equipment can be used
10 mL Vacutainer K2 EDTA tube	Becton Dickinson	367525	These tubes can be used for plasma collection
15 mL polypropylene centrifuge tubes	BIOFIL	CFT411150	Any standard tubes/equipment can be used
3.5 mL BD Vacutainer tube without anticoagulant	Becton Dickinson	368965	Either 8.5 or 3.5 mL tubes can be used for serum collection
4 mL polypropylene cryogenic vial, round bottom, self-standing	Corning	430662	Any standard tubes/equipment can be used
4 mL Vacutainer K2 EDTA tube	Becton Dickinson	367864	These tubes can be used for plasma collection
4200 TapeStation System	Agilent	G2991BA	Several quantification methods are available with a  specific application for cfDNA
5 mL serological disposable pipettes	BIOFIL	GSP010005	Any standard tubes/equipment can be used
8.5 mL BD Vacutainer tube without anticoagulant	Becton Dickinson	366468	Either 8.5 or 3.5 mL tubes can be used for serum collection
Centrifuge, capable of ~3000 x g with a swing bucket rotor	Thermo Fisher Scientific	Sorvall ST 16  10688725	Any standard tubes/equipment can be used
Freezer storage boxes for 1–4 mLcryogenic vials	Corning	431120	These boxes are needed when using 4 mL vials for storage
p1000 pipette tips	CORNING	4809	Any standard tubes/equipment can be used
QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit	Qiagen	55114	Any commercially available kit that is specific for cfDNA isolation can be used with this blood prcessing protocol.
Streck Cell-Free DNA BCT CE tubes 10 mL	Streck	218997	These tubes can be used for plasma collection
Temperature Freezer (-80 °C)	ESCO	2180104	Any standard tubes/equipment can be used