بروتوكول ما قبل التحليل المسبق للخزعة السائلة الموحدة لتطبيقات الحمض النووي الخالية من التداول في المراحل النهائية
Summary
لقد أحدثت الخزعة السائلة ثورة في نهجنا في الدراسات الانتقالية لعلم الأورام ، حيث يعد جمع العينات وجودتها وتخزينها خطوات حاسمة لتطبيقها السريري الناجح. هنا نصف بروتوكولا موحدا ومعتمدا لتطبيقات الحمض النووي الخالية من التداول في المراحل النهائية والتي يمكن تطبيقها في معظم مختبرات الأبحاث الانتقالية.
Abstract
يشير مصطلح الخزعة السائلة (LB) إلى جزيئات مثل البروتينات أو الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي أو الخلايا أو الحويصلات خارج الخلية في الدم وسوائل الجسم الأخرى التي تنشأ من الورم الأساسي و / أو النقيلي. برز LB كدعامة أساسية في البحوث الانتقالية وبدأ يصبح جزءا من ممارسة الأورام السريرية ، مما يوفر بديلا طفيف التوغل للخزعة الصلبة. يسمح LB بمراقبة الورم في الوقت الفعلي عن طريق استخراج عينة طفيفة التوغل ، مثل الدم. وتشمل التطبيقات الكشف المبكر عن السرطان، ومتابعة المرضى للكشف عن تطور المرض، وتقييم الحد الأدنى من الأمراض المتبقية، والتحديد المحتمل للتطور الجزيئي وآلية المقاومة. من أجل تحقيق تحليل موثوق به لهذه العينات التي يمكن الإبلاغ عنها في العيادة ، يجب النظر بعناية في إجراءات ما قبل التحليل واتباعها بدقة. يعد جمع العينات وجودتها وتخزينها خطوات حاسمة تحدد فائدتها في التطبيقات النهائية. هنا ، نقدم بروتوكولات موحدة من وحدة عمل الخزعة السائلة الخاصة بنا لجمع ومعالجة وتخزين عينات البلازما والمصل لتحليل الخزعة السائلة في المصب بناء على الحمض النووي الخالي من التداول. تتطلب البروتوكولات المعروضة هنا معدات قياسية ومرنة بما يكفي لتطبيقها في معظم المختبرات التي تركز على الإجراءات البيولوجية.
Introduction
تم تعريف مصطلح “الخزعة السائلة” في عام 20101 على أنه وجود جزيئات (مثل البروتين أو الحمض النووي الريبي النووي (DNA) أو الحمض النووي الريبي (RNA)) أو الخلايا أو الحويصلات خارج الخلية (على سبيل المثال ، الإكسوسومات) في الدم وسوائل الجسم الأخرى التي تنشأ من الورم الأساسي. أحدث استخدام عينات الخزعة السائلة ثورة في أبحاث الأورام الانتقالية حيث أن خزعات الأنسجة ، التي تقتصر على منطقة معينة في لحظة معينة ، قد تفوت النسخ المستنسخة ذات الصلة بسبب عدم تجانس الورم. بالإضافة إلى ذلك ، تلعب الخزعة السائلة دورا ذا صلة في أنواع الأورام حيث تكون الأنسجة الأولية نادرة أو لا يمكن الوصول إليها ، لأنها قد تتجنب الخزعة الغازية ، مما يقلل من التكاليف والمخاطر على المرضى. علاوة على ذلك ، تتطور الخصائص الجزيئية للورم باستمرار ويرجع ذلك أساسا إلى ضغط العلاج ، ويمكن لعينات الخزعة السائلة التقاط الديناميكيات النسيلية للورم حيث يمكن أخذها طوليا ، في أوقات سريرية وعلاجية مختلفة من المرض مثل خط الأساس ، على العلاج ، أفضل استجابة ، وعند تطور المرض أو حتى قبل ذلك. مفهوم “الخزعة السائلة في الوقت الحقيقي” يعني أنه يمكن مراقبة التغيرات الديناميكية في الورم في الوقت الفعلي ، مما يسمح بالطب الدقيق في هذا المرض. الخزعة السائلة لها العديد من التطبيقات المحتملة في العيادة ، بما في ذلك الفحص والكشف المبكر عن السرطان ، والمراقبة في الوقت الفعلي للمرض ، والكشف عن الحد الأدنى من الأمراض المتبقية ، ودراسة آليات مقاومة العلاج ، والتقسيم الطبقي للمرضى على المستوى العلاجي1. يعد الكشف المبكر عن تكرار المرض وتطوره حاجة سريرية غير ملباة في العديد من أنواع الأورام وهو عامل رئيسي في زيادة بقاء مرضى السرطان على قيد الحياة ونوعية حياتهم. قد تفتقر طرق التصوير الروتينية وعلامات الورم القابلة للذوبان إلى الحساسية و / أو الخصوصية المطلوبة لهذه المهمة. وبالتالي ، هناك حاجة ماسة إلى علامات تنبؤية جديدة في العيادة ، مثل تلك القائمة على تعميم الأحماض النووية الحرة.
تشمل أنواع العينات المستخدمة في دراسات الخزعة السائلة على سبيل المثال لا الحصر عينات الدم والبول واللعاب والبراز. يمكن أن تكون العينات الأخرى الخاصة بالورم عبارة عن شفطات الخلايا والسائل الدماغي الشوكي والسائل الجنبي والكيس وسائل الاستسقاء والبلغم وعصير البنكرياس2. قد تحتوي السوائل السابقة على أنواع مختلفة من المواد المشتقة من السرطان ، أو الخلايا السرطانية المتداولة (CTC) ، أو شظايا مثل الإكسوسومات والحمض النووي للورم المتداول الخالي من الخلايا (ctDNA). قد يتم تغليف الأحماض النووية في حويصلات خارج الخلية (EVs) أو إطلاقها في سوائل الجسم بسبب موت الخلايا وتلفها. يتم إطلاق الحمض النووي الحر المنتشر (cfDNA) بشكل رئيسي في مجرى الدم من الخلايا الماصة أو الميتة وهو موجود في جميع الأفراد ، مما يدل على زيادة المستويات في الأمراض الالتهابية أو الأورام3. Exosomes هي حويصلات صغيرة خارج الخلية (~ 30-150 نانومتر) تفرزها الخلايا التي تحتوي على الأحماض النووية والبروتينات والدهون. تشكل هذه الحويصلات جزءا من شبكة الاتصالات بين الخلايا وتوجد عادة في العديد من أنواع سوائل الجسم2. الأحماض النووية المغلقة داخل المركبات الكهربائية محمية من البيئة القاسية داخل سوائل الجسم، وبالتالي توفير طريقة أكثر قوة لدراسة هذه الجزيئات في إعداد الخزعة السائلة.
وعموما، فإن مستويات الأحماض النووية المتداولة في عينات الخزعة السائلة منخفضة جدا، وبالتالي هناك حاجة إلى طرق حساسة للكشف، مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي أو تسلسل الجيل التالي (NGS). تعد الإدارة قبل التحليلية للعينة أمرا بالغ الأهمية لمنع تحلل خلايا الدم وإطلاق الحمض النووي السليم ، مما يتسبب في تلوث cfDNA بالحمض النووي الجينومي. علاوة على ذلك ، يجب توخي الحذر عند استخراج العينات لتجنب وجود مثبطات لطرق التحليل القائمة على الإنزيم.
نقدم هنا طريقة موحدة لجمع وتخزين عينات البلازما والمصل ، وهي خطوة أولى حاسمة للتطبيقات النهائية القائمة على الخزعة السائلة ، بما في ذلك تحليلات الحمض النووي المتداولة.
Protocol
Representative Results
Discussion
الخزعة السائلة لها العديد من التطبيقات المحتملة في أوقات مختلفة أثناء إدارة السرطان. أولا ، عند التشخيص لتحديد العلامات الجزيئية للورم التي من شأنها أن تشير إلى وجود آفة ورم محتملة يمكن التحقيق فيها سريريا. ثانيا ، أثناء العلاج للمراقبة في الوقت الفعلي للمرض ، وتقييم الاستجابة الجزيئية ل…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر شبكة البحوث الطبية الحيوية في السرطان (CIBERONC) على دعمها ومنحة المشروع التالية: LB CIBERONC PLATFORM: CIBERONC PLATFORM لتوحيد وتعزيز الخزعة السائلة. PI رودريغو توليدو ، (CIBERONC) ، 2019-2021.
Materials
| 1.5 mL Eppendorf tubes | Eppendorf | 0030 120.086 | Any standard tubes/equipment can be used |
| 10 mL serological disposable pipettes | BIOFIL | GSP010010 | Any standard tubes/equipment can be used |
| 10 mL Vacutainer K2 EDTA tube | Becton Dickinson | 367525 | These tubes can be used for plasma collection |
| 15 mL polypropylene centrifuge tubes | BIOFIL | CFT411150 | Any standard tubes/equipment can be used |
| 3.5 mL BD Vacutainer tube without anticoagulant | Becton Dickinson | 368965 | Either 8.5 or 3.5 mL tubes can be used for serum collection |
| 4 mL polypropylene cryogenic vial, round bottom, self-standing | Corning | 430662 | Any standard tubes/equipment can be used |
| 4 mL Vacutainer K2 EDTA tube | Becton Dickinson | 367864 | These tubes can be used for plasma collection |
| 4200 TapeStation System | Agilent | G2991BA | Several quantification methods are available with a specific application for cfDNA |
| 5 mL serological disposable pipettes | BIOFIL | GSP010005 | Any standard tubes/equipment can be used |
| 8.5 mL BD Vacutainer tube without anticoagulant | Becton Dickinson | 366468 | Either 8.5 or 3.5 mL tubes can be used for serum collection |
| Centrifuge, capable of ~3000 x g with a swing bucket rotor | Thermo Fisher Scientific | Sorvall ST 16 10688725 | Any standard tubes/equipment can be used |
| Freezer storage boxes for 1–4 mLcryogenic vials | Corning | 431120 | These boxes are needed when using 4 mL vials for storage |
| p1000 pipette tips | CORNING | 4809 | Any standard tubes/equipment can be used |
| QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit | Qiagen | 55114 | Any commercially available kit that is specific for cfDNA isolation can be used with this blood prcessing protocol. |
| Streck Cell-Free DNA BCT CE tubes 10 mL | Streck | 218997 | These tubes can be used for plasma collection |
| Temperature Freezer (-80 °C) | ESCO | 2180104 | Any standard tubes/equipment can be used |
References
- Alix-Panabières, C., Pantel, K. Clinical applications of circulating tumor cells and circulating tumor DNA as liquid biopsy. Cancer Discovery. 6 (5), 479-491 (2016).
- Zhou, B., et al. Application of exosomes as liquid biopsy in clinical diagnosis. Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 144 (2020).
- Bettegowda, C., et al. Liquid biopsies: Genotyping circulating tumor DNA. Nature Medicine. 4 (6), (2014).
- Heitzer, E., et al. Recommendations for a practical implementation of circulating tumor DNA mutation testing in metastatic non-small-cell lung cancer. ESMO Open. 7 (2), 100399 (2022).
- Gennari, A., et al. ESMO Clinical Practice Guideline for the diagnosis, staging and treatment of patients with metastatic breast cancer. Annals of Oncology: Official Journal of the European Society for Medical Oncology. 32 (12), 1475-1495 (2021).
- Van Buren, T., Arwatz, G., Smits, A. J. A simple method to monitor hemolysis in real time. Scientific Reports. 10 (1), 5101 (2020).
- Ignatiadis, M., Sledge, G. W., Jeffrey, S. S. Liquid biopsy enters the clinic – implementation issues and future challenges. Nature Reviews. Clinical Oncology. 18 (5), 297-312 (2021).
- Sidstedt, M., et al. Inhibition mechanisms of hemoglobin, immunoglobulin G, and whole blood in digital and real-time PCR. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 410 (10), 2569-2583 (2018).
- Maass, K. K., et al. From sampling to sequencing: A liquid biopsy pre-analytic workflow to maximize multi-layer genomic information from a single tube. Cancers. 13 (12), 3002 (2021).
- Greytak, S. R., et al. Harmonizing cell-free DNA collection and processing practices through evidence-based guidance. Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 26 (13), 3104-3109 (2020).
- Trigg, R. M., Martinson, L. J., Parpart-Li, S., Shaw, J. A. Factors that influence quality and yield of circulating-free DNA: A systematic review of the methodology literature. Heliyon. 4 (7), 00699 (2018).
- Boissier, E., et al. The centrifuge brake impacts neither routine coagulation assays nor platelet count in platelet-poor plasma. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 58 (9), 185-188 (2020).
- Johansson, G., et al. Considerations and quality controls when analyzing cell-free tumor DNA. Biomolecular Detection and Quantification. 17, 100078 (2019).
- Casas-Arozamena, C., et al. Genomic profiling of uterine aspirates and cfDNA as an integrative liquid biopsy strategy in endometrial cancer. Journal of Clinical Medicine. 9 (2), 585 (2020).
- Alcoceba, M., et al. Liquid biopsy: a non-invasive approach for Hodgkin lymphoma genotyping. British Journal of Haematology. 195 (4), 542-551 (2021).
- Szpechcinski, A., et al. Cell-free DNA levels in plasma of patients with non-small-cell lung cancer and inflammatory lung disease. British Journal of Cancer. 113 (3), 476-483 (2015).
- Earl, J., et al. Somatic mutation profiling in the liquid biopsy and clinical analysis of hereditary and familial pancreatic cancer cases reveals kras negativity and a longer overall survival. Cancers. 13 (7), 1612 (2021).
- Lampignano, R., et al. Multicenter evaluation of circulating cell-free DNA extraction and downstream analyses for the development of standardized (pre)analytical work flows. Clinical Chemistry. 66 (1), 149-160 (2020).
- Febbo, P. G., et al. Minimum technical data elements for liquid biopsy data submitted to public databases. Clinical Pharmacology and Therapeutics. 107 (4), 730-734 (2020).
- De Mattos-Arruda, L., Siravegna, G. How to use liquid biopsies to treat patients with cancer. ESMO Open. 6 (2), 100060 (2021).
