液体活检彻底改变了我们的肿瘤学转化研究方法,样本收集、质量和储存是其成功临床应用的关键步骤。在这里,我们描述了一种标准化且经过验证的下游无循环DNA应用的方案,该协议可应用于大多数转化研究实验室。
术语液体活检(LB)是指来自原发性和/或转移性肿瘤的血液和其他体液中的蛋白质,DNA,RNA,细胞或细胞外囊泡等分子。LB已成为转化研究的中流砥柱,并开始成为临床肿瘤学实践的一部分,为实体活检提供了一种微创的替代方案。LB允许 通过 微创样本提取(例如血液)实时监测肿瘤。这些应用包括早期癌症检测、患者随访以检测疾病进展、评估最小残留疾病以及潜在识别分子进展和耐药机制。为了对这些可以在临床上报告的样品进行可靠的分析,应仔细考虑并严格遵守分析前程序。样品收集、质量和储存是确定其在下游应用中的有用性的关键步骤。在这里,我们介绍了液活检工作模块的标准化方案,用于收集、处理和储存血浆和血清样本,以便基于无循环DNA进行下游液体活检分析。这里介绍的协议需要标准设备,并且足够灵活,可以应用于大多数专注于生物程序的实验室。
术语“液体活检”在2010年被定义为 起源于原发肿瘤的血液和其他体液中存在分子(例如蛋白质,脱氧核糖核酸(DNA),核糖核酸(RNA)),细胞或细胞外囊泡(例如外泌体)。液体活检样本的使用彻底改变了转化肿瘤学研究,因为组织活检仅限于特定时刻的特定区域,由于肿瘤异质性,可能会错过相关的克隆。此外,液体活检在原发组织稀缺或无法获得的肿瘤类型中起着相关作用,因为它可以避免侵入性活检,从而降低患者的成本和风险。此外,肿瘤分子特征的不断发展主要是由于治疗压力,液体活检样品可以捕获肿瘤克隆动力学,因为它们可以纵向,在疾病的不同临床和治疗时间,如基线,治疗,最佳反应,疾病进展甚至之前。“实时液体活检”的概念意味着可以实时监测肿瘤的动态变化,从而允许对这种疾病进行精准医疗。液体活检在临床上具有许多潜在的应用,包括癌症的筛查和早期检测,疾病的实时监测,最小残留疾病的检测,治疗耐药性的研究机制以及治疗水平1的患者分层。在许多肿瘤类型中,早期发现疾病复发和进展是未满足的临床需求,是提高癌症患者生存率和生活质量的关键因素。常规成像方式和可溶性肿瘤标志物可能缺乏该任务所需的敏感性和/或特异性。因此,临床上迫切需要新的预测标志物,例如基于循环游离核酸的靶标物。
用于液体活检研究的样本类型包括但不限于血液、尿液、唾液和粪便样本。其他肿瘤特异性样本可以是细胞抽吸物、脑脊液、胸腔积液、囊肿和腹水液、痰液和胰液2.前一种液体可能含有不同类型的癌症衍生物质,循环肿瘤细胞(CTC),或片段,例如外泌体和无细胞循环肿瘤DNA(ctDNA)。核酸可能被包封在细胞外囊泡(EV)中,或由于细胞死亡和损伤而释放到体液中。循环游离DNA(cfDNA)主要从凋亡或坏死细胞释放到血液中,并且存在于所有个体中,在炎症或肿瘤疾病中显示水平升高3。外泌体是由含有核酸,蛋白质和脂质的细胞分泌的小细胞外囊泡(~30-150nm)。这些囊泡构成细胞间通信网络的一部分,常见于许多类型的体液中 2.封闭在EV内的核酸受到保护,免受体液中恶劣环境的影响,从而为在液体活检环境中研究这些分子提供了更强大的方法。
总体而言,液体活检样品中循环核酸的水平非常低,因此需要灵敏的检测方法,例如数字PCR或下一代测序(NGS)。样品的分析前管理对于防止血细胞裂解和完整DNA的释放至关重要,从而导致cfDNA被基因组DNA污染。此外,在提取样品时必须小心,以避免存在基于酶的分析方法的抑制剂。
在这里,我们提出了一种用于收集和储存血浆和血清样品的标准化方法,这是基于液体活检的下游应用(包括循环核酸分析)的关键第一步。
液体活检在癌症管理的不同时间具有许多潜在的应用。首先,在诊断时识别肿瘤分子标志物,这些标记物将表明存在潜在的肿瘤病变,可以在临床上进一步研究。其次,在治疗期间对疾病进行实时监测,评估治疗分子反应、克隆进化,以及早期发现疾病复发或治疗耐药性。最后,在手术治疗后,作为检测最小残留疾病的工具。欧洲肿瘤内科学会(ESMO)最近发布了在转移性非小细胞肺癌(NSCLC)中?…
The authors have nothing to disclose.
我们要感谢癌症生物医学研究网络(CIBERONC)的支持和以下项目资助:LB CIBERONC平台:用于液体活检标准化和促进的CIBERONC平台。PI罗德里戈托莱多,(西伯利亚),2019-2021。
1.5 mL Eppendorf tubes | Eppendorf | 0030 120.086 | Any standard tubes/equipment can be used |
10 mL serological disposable pipettes | BIOFIL | GSP010010 | Any standard tubes/equipment can be used |
10 mL Vacutainer K2 EDTA tube | Becton Dickinson | 367525 | These tubes can be used for plasma collection |
15 mL polypropylene centrifuge tubes | BIOFIL | CFT411150 | Any standard tubes/equipment can be used |
3.5 mL BD Vacutainer tube without anticoagulant | Becton Dickinson | 368965 | Either 8.5 or 3.5 mL tubes can be used for serum collection |
4 mL polypropylene cryogenic vial, round bottom, self-standing | Corning | 430662 | Any standard tubes/equipment can be used |
4 mL Vacutainer K2 EDTA tube | Becton Dickinson | 367864 | These tubes can be used for plasma collection |
4200 TapeStation System | Agilent | G2991BA | Several quantification methods are available with a specific application for cfDNA |
5 mL serological disposable pipettes | BIOFIL | GSP010005 | Any standard tubes/equipment can be used |
8.5 mL BD Vacutainer tube without anticoagulant | Becton Dickinson | 366468 | Either 8.5 or 3.5 mL tubes can be used for serum collection |
Centrifuge, capable of ~3000 x g with a swing bucket rotor | Thermo Fisher Scientific | Sorvall ST 16 10688725 | Any standard tubes/equipment can be used |
Freezer storage boxes for 1–4 mLcryogenic vials | Corning | 431120 | These boxes are needed when using 4 mL vials for storage |
p1000 pipette tips | CORNING | 4809 | Any standard tubes/equipment can be used |
QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit | Qiagen | 55114 | Any commercially available kit that is specific for cfDNA isolation can be used with this blood prcessing protocol. |
Streck Cell-Free DNA BCT CE tubes 10 mL | Streck | 218997 | These tubes can be used for plasma collection |
Temperature Freezer (-80 °C) | ESCO | 2180104 | Any standard tubes/equipment can be used |