Это исследование представляет новый протокол для непосредственного применения механической силы на ядро клетки через магнитные микрошарики, доставляемые в цитоплазму, и для проведения одновременной флуоресцентной визуализации живых клеток.
Фундаментальный вопрос в механобиологии заключается в том, как живые клетки воспринимают внеклеточные механические стимулы в контексте клеточной физиологии и патологии. Считается, что клеточное механо-ощущение внеклеточных механических стимулов проходит через мембранные рецепторы, связанный белковый комплекс и цитоскелет. Последние достижения в области механобиологии демонстрируют, что ядро клетки в самой цитоплазме может независимо воспринимать механические стимулы одновременно. Тем не менее, механистическое понимание того, как клеточное ядро воспринимает, преобразует и реагирует на механические стимулы, отсутствует, главным образом из-за технических проблем в доступе и количественной оценке механики ядра с помощью обычных инструментов. В этой статье описывается проектирование, изготовление и реализация нового магнитного силового привода, который применяет точные и неинвазивные 3D-механические стимулы для прямой деформации ядра клетки. Используя клетки, спроектированные CRISPR / Cas9, это исследование демонстрирует, что этот инструмент в сочетании с конфокальной флуоресцентной визуализацией с высоким разрешением позволяет выявить динамику в реальном времени механочувствительного yes-ассоциированного белка (YAP) в отдельных клетках в зависимости от деформации ядра. Этот простой метод может преодолеть существующий технологический разрыв в механобиологическом сообществе и дать ответы на пробел в знаниях, который существует в отношении между механотрансдукцией ядра и функцией клетки.
Это исследование направлено на разработку и применение новой техники для выяснения механобиологии ядра путем объединения магнитных приводов, которые применяют механическую силу непосредственно к ядру клетки, и конфокальной флуоресцентной микроскопии, которая одновременно отображает структурные и функциональные субклеточные изменения. Клетки воспринимают внеклеточные биофизические сигналы, включая жесткость тканей 1,2,3,4, давление интерстициальной жидкости и напряжение сдвига 5,6,7, топологию/геометрию поверхности 8,9,10,11,12 и напряжение растяжения/сжатия 13,14, 15,16. Биофизические сигналы преобразуются в биохимические сигналы и вызывают потенциальные последующие изменения экспрессии генов и поведения клеток – процесс, известный как механотрансдукция 17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27 . Для изучения процессов механотрансдукции было разработано множество методов применения механической силы к клеткам, таких как атомно-силовая микроскопия28, устройство растяжения клеток29, датчик силы био-MEMS (микроэлектромеханические системы) 15,30,31, реология сдвига32 и стереовидение System 33 . Недавний обзор обобщает подходы к применению внеклеточных механических сигналов и вмешательству в механозондирование34. На сегодняшний день большинство из этих методов применяют силу на клеточную плазматическую мембрану, и клетки непосредственно получают эти внеклеточные биофизические сигналы через мембранные рецепторы, такие как интегрин, кадгерин, ионные каналы и рецепторы, связанные с G-белком. Впоследствии они передают сигнал на внутриклеточный цитоскелет и ядро. Например, используя транслокацию yes-ассоциированного белка (YAP) в качестве индикатора механо-зондирования, показано, что клетки воспринимают механические сигналы жесткости субстрата и внеклеточного напряжения от клеточной мембраны и передают их через цитоскелет в ядро, чтобы индуцировать транслокацию YAP цитоплазмы в ядро28,35.
Последние данные свидетельствуют о том, что само ядро клетки является независимым механосенсором 8,36,37. Это доказано экспериментами, выполненными на изолированном ядре, собранном из клеток, где было выявлено, что ядра адаптивно изменяют свою жесткость в ответ на механическую силу, непосредственно приложенную на них36. Во время многих физиологических состояний ядра как в опухолевых, так и в здоровых клетках воспринимают внеклеточные биофизические сигналы и изменяют свои механические свойства и сборки 38,39,40. Например, при экстравазации ядерная жесткость опухолевых клеток уменьшается и сохраняет мягкость более 24 ч38. Во время миграции через замкнутое интерстициальное пространство ядра опухолевых клеток часто теряют и восстанавливают свою структурную целостность39. Однако способ, которым ядро воспринимает биофизический сигнал, неизвестен, хотя было обнаружено, что в нем участвуют несколько белков ядерной оболочки и семейств белков, таких как Lamin A / C и линкер нуклеоскелета и комплекса цитоскелетов (LINC) 38,41. Следовательно, новые неинвазивные методы, которые могут непосредственно прикладывать силу к ядру, отделят эффект передачи силы от клеточно-плазматической мембраны и цитоскелета и помогут прояснить ранее недоступные молекулярные механизмы ядерного механо-зондирования.
Исследования, в которых использовались оптические пинцеты для манипулирования органеллами42 и микрошариками, вводимыми в клетки43, показали технологическую способность непосредственно прикладывать силу к ядру. Однако метод оптического пинцета имеет несколько ограничений: (1) оптический пинцет с низкой пропускной способностью часто манипулирует только одной клеткой или микрогранулой за раз; и (2) потенциальное фотоповреждение и температурный артефакт-деформация ядра требуют десятков пН36, а соответствующая необходимая мощность лазера составляет около 10 мВт на пН 44,45. Такой интенсивности лазера достаточно, чтобы вызвать фотоповреждения в клетках и возмутить функции клеток во время эксперимента46.
Магнитная сила, приложенная через микрошарики в живых клетках, показывает потенциал непосредственного приложения силы к ядру и преодолевает ограничения оптического пинцета. Как только микрошарики доставляются в цитоплазму, магнитное поле может оказывать магнитную силу на несколько микрошариков одновременно с высокой пропускной способностью. Магнитное поле не влияет на функции ячейки47, но генерирует силу от pN до nN, которой достаточно, чтобы вызвать ядерную деформацию 36,48,49. На сегодняшний день манипуляции с магнитными микрошариками применяются на клеточной плазматической мембране48, внутри цитоплазмы50, на F-актине51, внутри ядра47 и на изолированном ядре36. Однако магнитные манипуляции с микрошариками никогда не использовались для применения прямой механической силы на ядерную оболочку для изучения механотрансдукции в ядре.
В этой статье разработан простой метод неинвазивной доставки магнитных микрошариков в цитоплазму и использования этих микрошариков для приложения механической силы к ядру (рисунок 1). Здесь для проверки метода используются нормальные клеточные линии человека, спроектированные CRISPR / Cas9, которые эндогенно экспрессируют mNeonGreen21-10/11 YAP. YAP является механочувствительным белком, и транслокация YAP регулируется ядерным механо-зондированием14,28. Подход, регулируемый CRISPR/Cas9, был выбран для маркировки эндогенного YAP флуоресцентным белком (FP) mNeonGreen21-10/11. Хотя известно, что редактирование CRISPR имеет неполную эффективность и нецелевой эффект, протоколы в предыдущих публикациях интегрировали флуоресцентную сортировку для выбора для правильной вставки открытого кадра чтения 52,53,54. С этим дополнительным слоем отбора не наблюдалось никакого события нецелевой маркировки в более чем 20 клеточных линиях, ранее сгенерированных 52,53,54,55. Это расщепленная флуоресцентная белковая конструкция, но в принципе любая экспрессируемая флуоресцентная метка может быть пригодна для использования. Этот подход к маркировке превосходит методы трансгенов или антител. Во-первых, в отличие от трансгенной экспрессии, меченый белок поддерживает дозировку гена с одной копией и экспрессируется в физиологическом контексте регуляторной сети нативного гена, ограничивая отклонения в концентрации белка, локализации и взаимодействии. Метод маркировки, используемый в этом исследовании, обеспечивает более высокую пропускную способность и эффективность на порядок, чем полная маркировка FP. Это также позволяет избежать проблем, связанных с иммунофлуоресценцией из-за артефактов фиксации и ограниченной доступности высококачественных антител с высокой специфичностью. Во-вторых, подход, используемый в этой статье, делает минимальное возмущение физиологии клеток и позволяет в режиме реального времени выявить все эндогенные YAP достоверно. Напротив, другие распространенные трансгенные методы часто приводят к гиперэкспрессии YAP. Полученное искусственное распределение может потенциально вызвать цитотоксичность и повлиять на механо-зондирование клеток 56,57,58.
В этом исследовании представлен протокол для непосредственного приложения силы к ядру через магнитные микрошарики, доставляемые в цитоплазму, и для проведения одновременной флуоресцентной визуализации живых клеток. Таким образом, представленные здесь протоколы демонстрируют, как (1) доставлять магнитные микрошарики в клетку, находясь вне ядра, (2) манипулировать микрошариками для приложения магнитной силы к ядру, (3) выполнять конфокальную флуоресцентную визуализацию клеток во время манипуляции и (4) количественно анализировать соотношение YAP ядерной / цитоплазмы (N / C) на протяжении всего процесса приложения силы. Результаты показывают, что (1) через эндоцитоз магнитные микрошарики могут быть неинвазивно доставлены в цитоплазму B2B-клеток в течение 7 ч (Рисунок 2 и Рисунок 3); и (2) количественная магнитная сила, непосредственно приложенная к ядру (рисунок 4, рисунок 5 и рисунок 6), сама по себе может вызвать различные изменения соотношения YAP N/C в ячейках B2B, спроектированных CRISPR/Cas9 (рисунок 7 и рисунок 8).
Интернализация магнитных микрошариков (раздел 2.2) имеет решающее значение, поскольку внеклеточные микрошарики не могут прикладывать силу непосредственно к ядру. Применение силы и визуализация (раздел 5.3) являются критическими шагами в этом эксперименте, и сила, необходимая для деформа…
The authors have nothing to disclose.
Этот проект финансируется UF Gatorade Award Start-up Package (X. T.), UFHCC Pilot Award (X. T. и Dr. Dietmar Siemann), UF Opportunity Seed Fund (X. T.) и UFHCC University Scholars Program (H. Y. Wang). Мы искренне ценим интеллектуальные дискуссии и техническую поддержку со стороны д-ра Джонатана Лихта (UFHCC), д-ра Рольфа Ренне (UFHCC), д-ра Кристофера Вульпе (UFHCC), д-ра Бланки Шармы (BME), д-ра Марка Шеплака (MAE & ECE), д-ра Даниэля Ферриса (BME), д-ра Малисы Сарнтиноранонт (MAE), д-ра Ашока Кумара (MAE), д-ра Бенджамина Кеселовски (BME), д-ра Брента Гила (RSC), д-ра Филиппа Фэна (ECE), Д-р Грегори А. Худалла (BME), д-р Стивен Гивизцани (OSSM), д-р Йенисель Круз-Алмейда (CDBS), д-р Роджер Филлингим (CD-BS), д-р Роберт Кодл (OMS), д-р Джон Нойберт (DN-OR), д-р Джастин Хилиард (нейрохирургия), д-р Тянь Хэ (Гарвардский университет), д-р Юхуа Тан (Гонконгский политехнический университет), д-р Джесси Л-С Ау (Институт фармакологии количественных систем), д-р Дэвид Хан (Университет Аризоны), и Группа поддержки компании «Никон» (д-р Хосе Серрано-Велес, Ларри Кордон и Джон Экман). Мы глубоко благодарны за эффективную поддержку со стороны всех членов исследовательских лабораторий Tang’ s, Yamaguchi’s, Sharma’s, Au’s, Siemann и Guan, а также всех сотрудников отдела UF MAE.
0.05 % Trypsin | Corning | 25-051-CI | |
25 cm2 flask | Corning | 156340 | |
7-µm mean diameter carbonyl iron microbeads | N/A | N/A | |
A1R confocal system | Nikon | ||
Carbonyl Iron Powder CM | BASF | 30042253 | Magnetic microbead |
Culture medium (RPMI-1640) | Gibco | 11875093 | |
Desktop Computer | Dell | with Windows 10 operating system | |
Environmental chamber TIZB | Tokai Hit | TIZB | |
Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 26140 | |
Fiji ImageJ | National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation | ||
Glass-bottom petri dish | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
Magnet | K&J Magnetics, Inc. | D99-N52 | |
Monochrome Camera | FLIR | BFS-U3-70S7M-C | |
NIS-Elements software platform | Nikon | software platform | |
Nucleus mask ImageJ macro | https://github.com/KOLIUG/Nuclear mask | ||
NucSpot Live 650 | Biotium | #40082 | Nuclear stain |
Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 10010023 | |
Ti2-E inverted microscope | Nikon | ||
XYZ mover (CAD files) | https://github.com/KOLIUG/XYZ-mover |