JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

Combinatie van 3D Magnetic Force Actuator en multifunctionele fluorescentie beeldvorming om Nucleus Mechanobiology te bestuderen

Published: July 05, 2022
doi:
10.3791/64098
, , , , , , , , ,
1Department of Mechanical and Aerospace Engineering, Herbert Wertheim College of Engineering,University of Florida, 2Department of Materials Science and Engineering,University of Florida, 3Department of Biostatistics,University of Florida, 4Department of Biomedical Engineering, College of Engineering (COE),University of Delaware (UD), 5UF Health Cancer Center,University of Florida, 6Department of Physics, College of Liberal Arts and Sciences,University of Florida, 7Department of Anatomy and Cell Biology, College of Medicine,University of Florida, 8J. Crayton Pruitt Family Department of Biomedical Engineering,University of Florida, 9Department of Physiology and Functional Genomics,University of Florida

Summary

Deze studie presenteert een nieuw protocol om direct mechanische kracht uit te oefenen op de celkern door middel van magnetische microbeads die in het cytoplasma worden afgeleverd en om gelijktijdige live-cell fluorescerende beeldvorming uit te voeren.

Abstract

Een fundamentele vraag in de mechanobiologie is hoe levende cellen extracellulaire mechanische stimuli waarnemen in de context van celfysiologie en pathologie. De cellulaire mechano-sensatie van extracellulaire mechanische stimuli wordt verondersteld zich te bevinden via de membraanreceptoren, het bijbehorende eiwitcomplex en het cytoskelet. Recente ontwikkelingen in de mechanobiologie tonen aan dat de celkern in het cytoplasma zelf onafhankelijk mechanische stimuli tegelijkertijd kan waarnemen. Een mechanistisch begrip van hoe de celkern mechanische stimuli detecteert, transduceert en erop reageert, ontbreekt echter, voornamelijk vanwege de technische uitdagingen bij het openen en kwantificeren van de kernmechanica met conventionele hulpmiddelen. Dit artikel beschrijft het ontwerp, de fabricage en de implementatie van een nieuwe magnetische krachtactuator die nauwkeurige en niet-invasieve 3D-mechanische stimuli toepast om de celkern direct te vervormen. Met behulp van CRISPR/Cas9-engineered cellen toont deze studie aan dat deze tool, in combinatie met hoge resolutie confocale fluorescerende beeldvorming, de onthulling mogelijk maakt van de real-time dynamiek van een mechano-gevoelig yes-associated protein (YAP) in enkele cellen als functie van kernvervorming. Deze eenvoudige methode heeft het potentieel om de huidige technologische kloof in de mechanobiologiegemeenschap te overbruggen en antwoorden te bieden op de kenniskloof die bestaat in de relatie tussen nucleusmechanotransductie en celfunctie.

Introduction

Deze studie heeft tot doel een nieuwe techniek te ontwikkelen en toe te passen om kernmechanobiologie op te helderen door de magnetische actuatoren die mechanische kracht rechtstreeks op de celkern uitoefenen te combineren met de confocale fluorescentiemicroscopie die tegelijkertijd de structurele en functionele subcellulaire veranderingen in beeld brengt. Cellen detecteren extracellulaire biofysische signalen, waaronder weefselstijfheid 1,2,3,4, interstitiële vloeistofdruk en schuifspanning 5,6,7, oppervlaktetopologie/geometrie 8,9,10,11,12 en spanning/compressiespanning 13,14, 15,16. Biofysische signalen worden omgezet in biochemische signalen en veroorzaken potentiële stroomafwaartse veranderingen van genexpressie en celgedrag – een proces dat bekend staat als mechanotransductie 17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27 . Om mechanotransductieprocessen te bestuderen, zijn talloze technieken ontwikkeld om mechanische kracht op de cellen uit te oefenen, zoals atoomkrachtmicroscopie28, celrekapparaat29, bio-MEMS (micro-elektromechanische systemen) krachtsensor 15,30,31, afschuifreologie 32 en Stereo Vision System33 . Een recente review vat de benaderingen samen om extracellulaire mechanische signalen toe te passen en te interfereren met mechanosensing34. Tot op heden oefenen de meeste van deze methoden kracht uit op het celplasmamembraan en cellen ontvangen deze extracellulaire biofysische signalen rechtstreeks via membraanreceptoren zoals integrine, cadherine, ionkanalen en G-eiwit-gekoppelde receptoren. Vervolgens geven ze het signaal door aan het intracellulaire cytoskelet en de kern. Bijvoorbeeld, met behulp van yes-associated protein (YAP) translocatie als een indicator van mechano-sensing, wordt aangetoond dat cellen de mechanische signalen van substraatstijfheid en extracellulaire spanning van het celmembraan detecteren en deze via het cytoskelet naar de kern overbrengen om YAP-cytoplasma-naar-kerntranslocatie te induceren28,35.

Recent bewijs suggereert dat de celkern zelf een onafhankelijke mechano-sensoris 8,36,37. Dit wordt bewezen door experimenten uitgevoerd op de geïsoleerde kern geoogst uit cellen, waar werd onthuld dat kernen adaptief hun stijfheid veranderen als reactie op de mechanische kracht die direct op hen wordt uitgeoefend36. Tijdens veel fysiologische omstandigheden voelen kernen in zowel tumor- als gezonde cellen extracellulaire biofysische signalen en veranderen hun mechanische eigenschappen en assemblages 38,39,40. Bijvoorbeeld, bij extravasatie neemt de nucleaire stijfheid van tumorcellen af en handhaaft de zachtheid gedurende meer dan 24 h38. Tijdens de migratie door de besloten interstitiële ruimte verliezen en herstellen de kernen van tumorcellen vaak hun structurele integriteit39. De manier waarop de kern het biofysische signaal waarneemt, is echter onbekend, hoewel verschillende nucleaire enveloppe-eiwitten en families van eiwitten betrokken zijn gebleken, zoals Lamin A / C en linker van nucleoskelet en cytoskelet (LINC) complex38,41. Vandaar dat nieuwe niet-invasieve methoden die direct kracht kunnen uitoefenen op de kern het effect van krachtoverdracht van het cel-plasmamembraan en cytoskelet zullen loskoppelen en zullen helpen de voorheen ontoegankelijke moleculaire mechanismen van nucleaire mechano-detectie op te helderen.

Onderzoek waarbij optische pincetten werden gebruikt om organellen42 te manipuleren en microbeads geïnjecteerd in cellen43 toonde het technologische vermogen aan om direct kracht uit te oefenen op de kern. De optische pincettechniek heeft echter verschillende beperkingen: (1) optische pincetten met lage doorvoer manipuleren vaak maar één cel of microbead tegelijk; en (2) potentiële fotoschade en temperatuurartefact-vervorming van kernenergie vereist tientallen pN36, en het overeenkomstige benodigde laservermogen is ongeveer 10 mW per pN 44,45. Een dergelijke laserintensiteit is voldoende om fotoschade in de cellen te veroorzaken en de functies van de perturbcel tijdens het experimentte verstoren 46.

Magnetische kracht toegepast door microbeads in levende cellen toont het potentieel om direct kracht uit te oefenen op de kern en overwint de beperkingen van optische pincetten. Zodra microbeads in het cytoplasma worden afgeleverd, kan een magnetisch veld een magnetische kracht uitoefenen op meerdere microbeads tegelijkertijd op een manier met hoge doorvoer. Het magnetisch veld beïnvloedt de celfuncties niet47, maar genereert kracht van pN naar nN, wat voldoende is om nucleaire vervorming te induceren 36,48,49. Tot op heden is manipulatie van magnetische microbeads toegepast op celplasmamembraan48, in het cytoplasma50, op F-actine51, in de kern47 en op de geïsoleerde kern36. Magnetische manipulatie van microbeads is echter nooit gebruikt om directe mechanische kracht op de nucleaire envelop toe te passen om mechanotransductie in de kern te bestuderen.

In dit artikel wordt een eenvoudige techniek ontwikkeld om niet-invasief magnetische microbeads in het cytoplasma af te leveren en deze microbeads te gebruiken om mechanische kracht op de kern uit te oefenen (figuur 1). Hier worden CRISPR / Cas9-engineered menselijke normale B2B-cellijnen gebruikt die endogeen mNeonGreen21-10 / 11-gelabelde YAP uitdrukken om de methode te valideren. YAP is een mechano-gevoelig eiwit en de translocatie van YAP wordt gereguleerd door nucleaire mechano-sensing14,28. De CRISPR/Cas9-gereguleerde knock-in benadering werd gekozen om endogene YAP te taggen met een fluorescerend eiwit (FP) mNeonGreen21-10/11. Hoewel bekend is dat CRISPR-bewerking onvolledige efficiëntie en off-target effect heeft, integreerden de protocollen in eerdere publicaties fluorescentiesortering om te selecteren op correcte open leesframe-invoeging 52,53,54. Met deze extra selectielaag werd geen off-target tagginggebeurtenis waargenomen in meer dan 20 cellijnen die eerder52,53,54,55 genereerden. Dit is een gesplitst fluorescerend eiwitconstruct, maar in principe zou elke expresseerbare fluorescerende tag bruikbaar kunnen zijn. Deze etiketteringsbenadering is superieur aan transgene- of antilichaammethoden. Ten eerste, in tegenstelling tot de transgene expressie, handhaaft het getagde eiwit single-copy gendosering en expressie in de fysiologische context van het inheemse gen regulerende netwerk, waardoor afwijkingen in eiwitconcentratie, lokalisatie en interactie worden beperkt. De taggingmethode die in deze studie wordt gebruikt, bereikt een orde van grootte hogere doorvoer en efficiëntie dan volledige FP-tagging. Het vermijdt ook uitdagingen in verband met immunofluorescentie als gevolg van fixatieartefacten en de beperkte beschikbaarheid van hoogwaardige antilichamen met hoge specificiteit. Ten tweede zorgt de benadering die in dit artikel wordt gebruikt voor minimale verstoring van de celfysiologie en maakt de real-time openbaring van alle endogene YAP’s op authentieke wijze mogelijk. Andere gangbare transgene methoden leiden daarentegen vaak tot overexpressie van YAP. De resulterende kunstmatige distributie kan mogelijk cytotoxiciteit veroorzaken en de mechano-detectie van cellen beïnvloeden 56,57,58.

Deze studie presenteert een protocol om direct kracht uit te oefenen op de kern door middel van magnetische microbeads die in het cytoplasma worden afgeleverd en om gelijktijdige live-cell fluorescerende beeldvorming uit te voeren. Samenvattend laten de hier gepresenteerde protocollen zien hoe (1) magnetische microbeads in de cel kunnen worden afgeleverd terwijl ze zich buiten de kern bevinden, (2) de microbeads manipuleren om magnetische kracht op de kern uit te oefenen, (3) confocale fluorescerende beeldvorming van de cellen uitvoeren tijdens manipulatie, en (4) kwantitatief de YAP-verhouding tussen nucleair en cytoplasma (N / C) analyseren tijdens het krachttoepassingsproces. De resultaten suggereren dat (1) door endocytose magnetische microbeads niet-invasief kunnen worden afgeleverd in het cytoplasma van B2B-cellen binnen 7 uur (figuur 2 en figuur 3); en (2) gekwantificeerde magnetische kracht die rechtstreeks op de kern wordt uitgeoefend (figuur 4, figuur 5 en figuur 6) alleen kan leiden tot diverse veranderingen in de YAP N/C-verhouding in CRISPR/Cas9-gemanipuleerde B2B-cellen (figuur 7 en figuur 8).

Protocol

1. Onderhoud van CRISPR/Cas9-engineered B2B cellen Kweek B2B-cellen in een T25-kolf met RPMI-1640 aangevuld met 10% foetaal runderserum en 1% penicilline-streptomycine. Bewaar de B2B-cellen in een bevochtigde incubator op 37 °C met 5% CO2. Subcultuur de B2B-cellen wanneer de samenvloeiing 70% tot 80% bereikt. Bewaar de B2B cellijn in RPMI-1640 kweekmedium met 10% (v/v) DMSO in een -80 °C vriezer. Gebruik de B2B-cellen met een passagegetal van…

Representative Results

Ontwerp van een magneetbewegend apparaat en toepassing van magnetische krachtOm kracht uit te oefenen op de kern door de magnetische microbeads, werd een magneetbewegend apparaat ontworpen en gebouwd om de ruimtelijke positie van de magneet te regelen. Het magneetbewegende apparaat bevat een centraal frame, drie knoppen en rails om de aangesloten magneet onafhankelijk van elkaar in x-, y- en z-richting te bewegen met een ruimtelijke resolutie van 1,59 mm per cyclus (figuur 1A</st…

Discussion

Internalisatie van magnetische microbeads (sectie 2.2) is van cruciaal belang omdat extracellulaire microbeads niet rechtstreeks kracht kunnen uitoefenen op de kern. Krachttoepassing en beeldvorming (paragraaf 5.3) zijn kritieke stappen in dit experiment en de kracht die nodig is om de kern te vervormen en zinvolle biologische gevolgen te veroorzaken, kan steekproefafhankelijk zijn. De krachtmagnitude in dit experiment (0,8 nN en 1,4 nN) kan verder worden verhoogd om nucleaire mechano-detectie in minder gevoelige cellen …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit project wordt gefinancierd door UF Gatorade Award Start-up Package (X. T.), de UFHCC Pilot Award (X. T. en Dr. Dietmar Siemann), UF Opportunity Seed Fund (X. T.) en UFHCC University Scholars Program (H. Y. Wang). We waarderen oprecht de intellectuele discussies met en de technische ondersteuning van Dr. Jonathan Licht (UFHCC), Dr. Rolf Renne (UFHCC), Dr. Christopher Vulpe (UFHCC), Dr. Blanka Sharma (BME), Dr. Mark Sheplak (MAE &ECE), Dr. Daniel Ferris (BME), Dr. Malisa Sarntinoranont (MAE), Dr. Ashok Kumar (MAE), Dr. Benjamin Keselowsky (BME), Dr. Brent Gila (RSC), Dr. Philip Feng (ECE), Dr. Gregory A. Hudalla (BME), Dr. Steven Ghivizzani (OSSM), Dr. Yenisel Cruz-Almeida (CDBS), Dr. Roger Fillingim (CD-BS), Dr. Robert Caudle (OMS), Dr. John Neubert (DN-OR), Dr. Justin Hiliard (Neurochirurgie), Dr. Tian He (Harvard University), Dr. Youhua Tan (Hong Kong Polytechnic University), Dr. Jessie L-S Au (Institute of Quantitative Systems Pharmacology), Dr. David Hahn (Universiteit van Arizona), en ondersteuningsteam van Nikon (Drs. Jose Serrano-Velez, Larry Kordon en Jon Ekman). We zijn zeer dankbaar voor de effectieve steun van alle leden van Tang’s, Yamaguchi’s, Sharma’s, Au’s, Siemann’s en Guan’s onderzoekslaboratoria en alle medewerkers van de UF MAE-afdeling.

Materials

0.05 % Trypsin Corning 25-051-CI
25 cm2 flask Corning 156340
7-µm mean diameter carbonyl iron microbeads N/A N/A
A1R confocal system Nikon
Carbonyl Iron Powder CM BASF 30042253 Magnetic microbead
Culture medium (RPMI-1640) Gibco 11875093
Desktop Computer Dell with Windows 10 operating system
Environmental chamber TIZB Tokai Hit TIZB
Fetal bovine serum (FBS) Gibco 26140
Fiji ImageJ National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation
Glass-bottom petri dish MatTek P35G-1.5-14-C
Magnet K&J Magnetics, Inc. D99-N52
Monochrome Camera FLIR BFS-U3-70S7M-C
NIS-Elements software platform Nikon software platform
Nucleus mask ImageJ macro https://github.com/KOLIUG/Nuclear mask
NucSpot Live 650 Biotium #40082 Nuclear stain
Penicillin-streptomycin Gibco 15140122
Phosphate buffered saline (PBS) Gibco 10010023
Ti2-E inverted microscope Nikon
XYZ mover (CAD files) https://github.com/KOLIUG/XYZ-mover
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).
  2. Janmey, P. A., Fletcher, D. A., Reinhart-King, C. A. Stiffness sensing by cells. Physiological Reviews. 100 (2), 695-724 (2020).
  3. Bajaj, P., Tang, X., Saif, T. A., Bashir, R. Stiffness of the substrate influences the phenotype of embryonic chicken cardiac myocytes. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 95 (4), 1261-1269 (2020).
  4. Tang, X., et al. Mechanical force affects expression of an in vitro metastasis-like phenotype in HCT-8 cells. Biophysical Journal. 99 (8), 2460-2469 (2010).
  5. Hofmann, M., et al. Lowering of tumor interstitial fluid pressure reduces tumor cell proliferation in a xenograft tumor model. Neoplasia. 8 (2), 89-95 (2006).
  6. Yankaskas, C. L., et al. The fluid shear stress sensor TRPM7 regulates tumor cell intravasation. Science Advances. 7 (28), (2021).
  7. Kim, E., et al. A biosynthetic hybrid spidroin-amyloid-mussel foot protein for underwater adhesion on diverse surfaces. ACS Applied Materials and Interfaces. 13 (41), 48457-48468 (2021).
  8. Tajik, A., et al. Transcription upregulation via force-induced direct stretching of chromatin. Nature Materials. 15 (12), 1287-1296 (2016).
  9. Lee, J., Abdeen, A. A., Tang, X., Saif, T. A., Kilian, K. A. Matrix directed adipogenesis and neurogenesis of mesenchymal stem cells derived from adipose tissue and bone marrow. Acta Biomaterialia. 42, 46-55 (2016).
  10. Lee, J., Abdeen, A. A., Tang, X., Saif, T. A., Kilian, K. A. Geometric guidance of integrin mediated traction stress during stem cell differentiation. Biomaterials. 69, 174-183 (2015).
  11. Ren, B., et al. Study of sacrificial ink-assisted embedded printing for 3D perfusable channel creation for biomedical applications. Applied Physics Reviews. 9 (1), 011408 (2022).
  12. Coyle, S., et al. Cell alignment modulated by surface nano-topography-Roles of cell-matrix and cell-cell interactions. Acta Biomaterialia. 142, 149-159 (2022).
  13. Sawada, Y., et al. Force sensing by mechanical extension of the Src family kinase substrate p130Cas. Cell. 127 (5), 1015-1026 (2006).
  14. Aragona, M., et al. A mechanical checkpoint controls multicellular growth through YAP/TAZ regulation by actin-processing factors. Cell. 154 (5), 1047-1059 (2013).
  15. Tang, X., et al. Specific and non-specific adhesion in cancer cells with various metastatic potentials. Mechanobiology of Cell-Cell and Cell-Matrix Interactions. , 105-122 (2011).
  16. Tang, X., Saif, T. A. Adhesivity of colon cancer cells during in vitro metastasis. International Journal of Applied Mechanics. 5 (03), 1350025 (2013).
  17. Chaudhuri, O., et al. Effects of extracellular matrix viscoelasticity on cellular behaviour. Nature. 584 (7822), 535-546 (2020).
  18. Ohashi, K., Fujiwara, S., Mizuno, K. Roles of the cytoskeleton, cell adhesion and rho signalling in mechanosensing and mechanotransduction. The Journal of Biochemistry. 161 (3), 245-254 (2017).
  19. Hamill, O. P., Martinac, B. Molecular basis of mechanotransduction in living cells. Physiological Reviews. 81 (2), 685-740 (2001).
  20. Liang, C., et al. Towards an integrative understanding of cancer mechanobiology: Calcium, YAP, and microRNA under biophysical Forces. Soft Matter. 18, 1112-1148 (2022).
  21. Tan, Y., et al. Matrix softness regulates plasticity of tumour-repopulating cells via H3K9 demethylation and Sox2 expression. Nature Communications. 5 (1), 1-12 (2014).
  22. Poh, Y., et al. Dynamic force-induced direct dissociation of protein complexes in a nuclear body in living cells. Nature Communications. 3 (1), 1-10 (2012).
  23. Tang, X., et al. A mechanically-induced colon cancer cell population shows increased metastatic potential. Molecular Cancer. 13 (1), 1-15 (2014).
  24. Wu, J., et al. Effects of dynein on microtubule mechanics and centrosome positioning. Molecular Biology of the Cell. 22 (24), 4834-4841 (2011).
  25. Tang, X., Ali, M. Y., Saif, M. T. A novel technique for micro-patterning proteins and cells on polyacrylamide gels. Soft Matter. 8 (27), 7197-7206 (2011).
  26. Tang, X., Bajaj, P., Bashir, R., Saif, T. A. How far cardiac cells can see each other mechanically. Soft Matter. 7 (13), 6151-6158 (2011).
  27. Tang, X., et al. Mechanical force affects expression of an in vitro metastasis-like phenotype in HCT-8 cells. Biophysical Journal. 99 (8), 2460-2469 (2010).
  28. Elosegui-Artola, A., et al. Force triggers YAP nuclear entry by regulating transport across nuclear pores. Cell. 171 (6), 1397-1410 (2017).
  29. Gudipaty, S. A., et al. Mechanical stretch triggers rapid epithelial cell division through Piezo1. Nature. 543 (7643), 118-121 (2017).
  30. Tang, X., et al. Attenuation of cell mechanosensitivity in colon cancer cells during in vitro metastasis. PLoS One. 7 (11), 50443 (2012).
  31. Cha, C., et al. Top-down synthesis of versatile polyaspartamide linkers for single-step protein conjugation to materials. Bioconjugate Chemistry. 22 (12), 2377-2382 (2012).
  32. Chen, X., et al. Glycosaminoglycans modulate long-range mechanical communication between cells in collagen networks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (15), (2022).
  33. Boyle, J. J., Pless, R. B., Thomopoulos, S., Genin, G. M. Direct estimation of surface strain fields from a stereo vision system. Journal of Biomechanical Engineering. 142 (7), 074503 (2020).
  34. Kim, S., Uroz, M., Bays, J. L., Chen, C. S. Harnessing mechanobiology for tissue engineering. Developmental Cell. 56 (2), 180-191 (2021).
  35. Driscoll, T. P., et al. Cytoskeletal to nuclear strain transfer regulates YAP signaling in mesenchymal stem cells. Biophysical Journal. 108 (12), 2783-2793 (2015).
  36. Guilluy, C., et al. Isolated nuclei adapt to force and reveal a mechanotransduction pathway in the nucleus. Nature Cell Biology. 16 (4), 376-381 (2014).
  37. Vashisth, M. Scaling concepts in ‘omics: Nuclear lamin-B scales with tumor growth and often predicts poor prognosis, unlike fibrosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (48), (2021).
  38. Roberts, A. B., et al. Tumor cell nuclei soften during transendothelial migration. Journal of Biomechanics. 121, 110400 (2021).
  39. Denais, C. M., et al. Nuclear envelope rupture and repair during cancer cell migration. Science. 352 (6283), 353-358 (2016).
  40. Raab, M., et al. ESCRT III repairs nuclear envelope ruptures during cell migration to limit DNA damage and cell death. Science. 352 (6283), 359-362 (2016).
  41. Lammerding, J., et al. Lamin A/C deficiency causes defective nuclear mechanics and mechanotransduction. The Journal of Clinical Investigation. 113 (3), 370-378 (2004).
  42. Shelby, J., Patrick, J., Edgar, S., Chiu, D. T. Monitoring cell survival after extraction of a single subcellular organelle using optical trapping and pulsed-nitrogen laser ablation. Photochemistry and Photobiology. 81 (4), 994-1001 (2005).
  43. Caspi, A., Granek, R., Elbaum, M. Diffusion and directed motion in cellular transport. Physical Review E. 66 (1), 011916 (2002).
  44. Svoboda, K., Block, S. M. Biological applications of optical forces. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 23 (1), 247-285 (1994).
  45. Rohrbach, A. Stiffness of optical traps: quantitative agreement between experiment and electromagnetic theory. Physical Review Letters. 95 (16), 168102 (2005).
  46. Neuman, K. C., et al. Characterization of photodamage to Escherichia coli in optical traps. Biophysical Journal. 77 (5), 2856-2863 (1999).
  47. Kanger, J. S., Subramaniam, V., Driel, R. V. Intracellular manipulation of chromatin using magnetic microbeads. Chromosome Research. 16 (3), 511-522 (2008).
  48. Bausch, A. R., et al. Local measurements of viscoelastic parameters of adherent cell surfaces by magnetic microbead microrheometry. Biophysical Journal. 75 (4), 2038-2049 (1998).
  49. Fisher, J. K., et al. Three-dimensional force microscope: a nanometric optical tracking and magnetic manipulation system for the biomedical sciences. Review of Scientific Instruments. 76 (5), 053711 (2005).
  50. Berret, J. -. F. Local viscoelasticity of living cells measured by rotational magnetic spectroscopy. Nature Communications. 7, 10134 (2016).
  51. Hu, B., Dobson, J., El Haj, A. J. Control of smooth muscle α-actin (SMA) up-regulation in HBMSCs using remote magnetic microbead mechano-activation. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 10 (1), 45-55 (2014).
  52. Kamiyama, D., et al. Versatile protein tagging in cells with split fluorescent protein. Nature Communications. 7, 11046 (2016).
  53. Feng, S., et al. Improved split fluorescent proteins for endogenous protein labeling. Nature Communications. 8, 370 (2017).
  54. Leonetti, M. D., Sekine, S., Kamiyama, D., Weissman, J. S., Huang, B. A scalable strategy for high-throughput GFP tagging of endogenous human proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (25), 3501-3508 (2016).
  55. Tulpule, A., et al. Kinase-mediated RAS signaling via membraneless cytoplasmic protein granules. Cell. 184 (10), 2649-2664 (2021).
  56. Ansari, A. M., et al. Cellular GFP toxicity and immunogenicity: potential confounders in in vivo cell tracking experiments. Stem Cell Reviews and Reports. 12 (5), 553-559 (2016).
  57. Gibson, T. J., Seiler, M., Veitia, R. A. The transience of transient overexpression. Nature Methods. 10 (8), 715-721 (2013).
  58. Ratz, M., et al. CRISPR/Cas9-mediated endogenous protein tagging for RESOLFT super-resolution microscopy of living human cells. Scientific Reports. 5, 9592 (2015).
  59. Suzuki, H., Ho, C., Kasagi, N. A chaotic mixer for magnetic microbead-based micro cell sorter. Journal of Microelectromechanical Systems. 13 (5), 779-790 (2004).
  60. Luo, Q., et al. All-optical mechanobiology interrogation of yes-associated protein in human cancer and normal cells using a multi-functional system. Journal of Visualized Experiments. (178), e62934 (2021).
  61. Koushki, N., et al. Lamin A redistribution mediated by nuclear deformation determines dynamic localization of YAP. BioRxiv. , (2020).

Tags

3D Magnetic Force ActuatorMulti-functional Fluorescence ImagingNucleus MechanobiologyMagnetic MicrobeadsCell InternalizationConfocal Fluorescence ImagingLive-cell ImagingNuclear StainYES-associated Protein (YAP)Cell BoundaryCytoskeletonOptical TweezersCell FunctionsHigh Throughput

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Huang, M., Wang, H., Delgado, A. A., Reid, T. A., Long, J., Wang, S., Sussman, H., Guan, J., Yamaguchi, H., Tang, X. Combining 3D Magnetic Force Actuator and Multi-Functional Fluorescence Imaging to Study Nucleus Mechanobiology. J. Vis. Exp. (185), e64098, doi:10.3791/64098 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image