Protokol, Flt3L eksprese eden B16-F10 melanomu ile hücre bazlı tümör aşılamasını kullanan bir kanser immünoterapi modeli sunmaktadır. Bu protokol, kültürlenmiş tümör hücrelerinin hazırlanması, tümör implantasyonu, hücre ışınlaması, tümör büyümesinin ölçülmesi, intratümöral immün hücrelerin izolasyonu ve akış sitometrisi analizi dahil olmak üzere prosedürleri göstermektedir.
Fms benzeri tirozin kinaz 3 ligand (Flt3L), dendritik hücrelerin (DC’ler) hayatta kalmasını ve farklılaşmasını destekleyen hematopoetik bir sitokindir. Tümör aşılarında doğuştan gelen bağışıklığı aktive etmek ve antitümör yanıtlarını arttırmak için kullanılmıştır. Bu protokol, Flt3L eksprese eden B16-F10 melanom hücrelerinden oluşan hücre bazlı tümör aşısının yanı sıra tümör mikroortamındaki (TME) bağışıklık hücrelerinin fenotipik ve fonksiyonel analizini kullanan terapötik bir model göstermektedir. Kültürlü tümör hücresi hazırlığı, tümör implantasyonu, hücre ışınlaması, tümör boyutu ölçümü, intratümöral immün hücre izolasyonu ve akım sitometri analizi için prosedürler tanımlanmıştır. Bu protokolün genel amacı, klinik öncesi katı tümör immünoterapi modeli ve tümör hücreleri ile infiltrasyon yapan bağışıklık hücreleri arasındaki ilişkiyi incelemek için bir araştırma platformu sağlamaktır. Burada tarif edilen immünoterapi protokolü, melanomun kanser terapötik etkisini iyileştirmek için immün kontrol noktası blokajı (anti-CTLA-4, anti-PD-1, anti-PD-L1 antikorları) veya kemoterapi gibi diğer terapötik modalitelerle birleştirilebilir.
Kanser immünoterapisi, daha az toksik yan etkileri ve daha dayanıklı yanıtlarına dayanan umut verici bir terapötik strateji olarak kabul edilmiştir. Onkolitik virüs tedavileri, kanser aşıları, sitokin tedavileri, monoklonal antikorlar, evlat edinen hücre transferi (CAR-T hücreleri veya CAR-NK) ve immün kontrol noktası blokajı1 dahil olmak üzere çeşitli immünoterapi türleri geliştirilmiştir.
Kanser aşıları için, tüm hücre bazlı aşılar, protein veya peptit aşıları ve RNA veya DNA aşıları gibi farklı terapötik aşı formları vardır. Aşılama, antijen sunan hücrelerin (APC’ler) tümöre özgü antijenler de dahil olmak üzere tümör antijenlerini işleme ve bunları T hücrelerine immünojenik bir biçimde sunma yeteneğine dayanır. Dendritik hücrelerin (DC’ler) en güçlü APC’ler olduğu bilinmektedir ve antitümör immünitesinde önemli bir rol oynadığına inanılmaktadır 2,3. Bu hücreler tümör antijenlerini alır ve işler ve daha sonra T-hücresi reseptörü (TCR) ve kostimülatör moleküllerin katılımı yoluyla tümöre özgü T efektör (Teff) hücrelerini astarlamak ve aktive etmek için drenaj lenf düğümlerine (dLN) göç eder. Bu, tümöre sızan ve tümör hücrelerini öldüren tümöre özgü sitotoksik T hücrelerinin (CTL) farklılaşması ve genişlemesi ile sonuçlanır4. Sonuç olarak, DC’lerin aktivasyonu ve olgunlaşması, tümör antijenlerine karşı bağışıklığı uyarmak için çekici stratejileri temsil eder.
Flt3L’nin, MHC sınıf II, CD11c, DEC205 ve CD86 proteinlerini5 eksprese eden fonksiyonel olarak olgun DC’lerin olgunlaşmasını ve genişlemesini teşvik ettiği bilinmektedir. Flt3L genini (Adv-Flt3L ) içeren bir adenovirüs vektörünün intratümöral, ancak intravenöz olmayan uygulamasının, ortrotopik tümörlere karşı immün terapötik aktiviteyi teşvik ettiği gösterilmiştir6. Flt3L ayrıca, tümör antijenlerinin DC’ler tarafından çapraz sunumunu arttırmanın ve böylece antitümör yanıtlarını arttırmanın bir yolu olarak retroviral olarak transdüke edilmiş Flt3L’yi kararlı bir şekilde eksprese eden ışınlanmış B16-F10 hücrelerinden oluşan tümör hücresi bazlı aşılarda da kullanılmıştır. Burada açıklanan B16-Flt3L tümör aşılama protokolü, Dr. James Allison’ın grup7’si tarafından yayınlanan bir çalışmaya dayanmaktadır. Bu yazıda, CTLA-4 blokajı ile kombine edilen bir B16-Flt3L aşısının, yerleşik melanomun reddini sinerjik olarak indüklediğini ve sağkalımın artmasına neden olduğunu bildirmişlerdir.
Bu protokolün amacı, melanom için klinik öncesi bir immünoterapi modeli sağlamaktır. Burada, tümör aşılarının nasıl hazırlanacağı ve implante edileceği ve katı tümörden intratümöral immün hücrelerin bileşiminin ve işlevinin nasıl analiz edileceği hakkında ayrıntılı prosedürler açıklanmaktadır.
Burada açıklanan protokol, Allison’ın grubu tarafından yapılan çalışmaya dayanıyor. B16-Flt3L aşısının CTLA-4 blokajı ile kombinasyonunun sağkalım oranı ve tümör büyümesi üzerinde sinerjik bir etki gösterdiğini, oysa B16-Flt3L aşısı veya tek başına anti-CTLA-4 antikor tedavisi alan farelerde tümör büyümesinde bir azalma görülmediğini gösterdiler7. Son zamanlarda yapılan çalışmalar, Treg11’in temasa bağımlı baskılayıcı aktivites…
The authors have nothing to disclose.
B16-Flt3L hücreleri sağladığı için Dr. Stephen Schoenberger’e ve LJI hayvan ve akış sitometri tesislerinin personeline mükemmel destek için teşekkür ederiz.
0.25% trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
10% heat-inactivated FBS | Omega Scientific | FB-02 | Lot# 209018 |
30G needle | BD Biosciences | 305106 | |
96 well V-shape-bottom plate | SARSTEDT | 83.3926.500 | |
B16 cell line expressing Fms-like tyrosine kinase 3 ligand (B16-Flt3L) | Gift of Dr. Stephen Schoenberger, LJI | Flt3L cDNAs were cloned into the pMG-Lyt2 retroviral vector, as in refernce 5, Supplemental Figure 1 | |
B16-F10 cell lines | ATCC | CRL-6475 | |
Centrifuge 5810R | Eppendorf | ||
Cytofix fixation buffer | BD Biosciences | BDB554655 | Cell fixation buffer (4.2% PFA) |
Cytofix/Cytoperm kit | BD Biosciences | 554714 | Fixation/Permeabilization Solution Kit |
DNase I | Sigma | 11284932001 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Corning | 10013CV | |
Electronic digital caliper | Fisherbrand | 14-648-17 | |
FlowJo software | Tree Star | Flow cytometer data analysis | |
GolgiStop (protein transport inhibitor) | BD Biosciences | 554724 | 1:1500 dilution |
HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
Ionomycin | Sigma | I0634 | |
Iscove’s modified Dulbecco’s medium (IMDM) | Thermo Fisher | 12440053 | |
LSR-II cytometers | BD Biosciences | Flow cytometer | |
MEM nonessential amino acids | Gibco | 11140-050 | |
penicillin and streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
Percoll | GE Healthcare Life Sciences | GE17-0891-02 | density gradient specific medium |
PMA | Sigma | P1585 | |
Red Blood Cell Lysing Buffer Hybri-Max liquid | Sigma | R7757-100ML | |
RPMI 1640 medium | Corning | 10-040-CV | |
RS2000 X-ray Irradiator | Rad Source Technologies | ||
sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
Sterile cell strainer 40 μm | Fisherbrand | 22-363-547 | |
Sterile cell strainer 70 μm | Fisherbrand | 22-363-548 | |
TL Liberase | Roche | 477530 | |
Zombie Aqua fixable viability kit | BioLegend | 423101 | |
Antibodies | |||
Anti-mCD45 | BioLegend | 103135 | Clone: 30-F11 Fluorophore: BV570 Dilution: 1:200 |
Anti-mCD3ε | BioLegend | 100327 | Clone: 145-2C11 Fluorophore: PerCP-Cy5.5 Dilution: 1:200 |
Anti-mCD8 | BioLegend | 100730 100724 |
Clone: 53-6.7 Fluorophore: Alexa Fluor 700, Alexa Fluor 647 Dilution: 1:200 |
Anti-mCD4 | BioLegend | 100414 | Clone: GK1.5 Fluorophore: APC-Cy7 Dilution: 1:200 |
Anti-mFoxp3 | Thermo Fisher Scientific | 11577382 | Clone: FJK-16s Fluorophore: FITC Dilution: 1:100 |
Anti-m/hGzmB | BioLegend | 372208 | Clone: QA16A02 Fluorophore: PE Dilution: 1:100 |
Anti-mIFNg | BioLegend | 505826 | Clone: XMG1.2 Fluorophore: PE-Cy7 Dilution: 1:100 |
Anti-mCD19 | BioLegend | 115543 | Clone: 6D5 Fluorophore: BV785 Dilution: 1:100 |
Anti-mGr1 | BioLegend | 108423 | Clone: RB6-8C5 Fluorophore: APC/Cy7 Dilution: 1:200 |
Anti-mCD11b | BioLegend | 101223 | Clone: M1/70 Fluorophore: Pacific blue Dilution: 1:100 |
Anti-mF4/80 | BioLegend | 123114 | Clone: BM8 Fluorophore: PECy7 Dilution: 1:100 |
Anti-mCD11c | BioLegend | 117328 | Clone: N418 Fluorophore: PerCP Cy5.5 Dilution: 1:100 |
Anti-mMHCII | BioLegend | 107622 | Clone: M5/114.15.2 Fluorophore: AF700 Dilution: 1:400 |
Anti-mCD103 | BioLegend | 121410 | Clone: 2E7 Fluorophore: Alexa Fluor 647 Dilution: 1:200 |
Anti-mCD86 | BioLegend | 105007 | Clone: GL-1 Fluorophore: PE Dilution: 1:200 |
FC-blocker (Rat anti-mouse CD16/CD32) | BD Biosciences | 553141 | Clone: 2.4G2 Dilution: 1:200 |