Le protocole présente un modèle d’immunothérapie du cancer utilisant la vaccination tumorale cellulaire avec le mélanome B16-F10 exprimant Flt3L. Ce protocole démontre les procédures, y compris la préparation de cellules tumorales en culture, l’implantation tumorale, l’irradiation cellulaire, la mesure de la croissance tumorale, l’isolement des cellules immunitaires intratumorales et l’analyse par cytométrie en flux.
Le ligand tyrosine kinase 3 de type FMS (Flt3L) est une cytokine hématopoïétique qui favorise la survie et la différenciation des cellules dendritiques (DC). Il a été utilisé dans les vaccins contre les tumeurs pour activer l’immunité innée et améliorer les réponses antitumorales. Ce protocole démontre un modèle thérapeutique utilisant un vaccin tumoral à base de cellules composé de cellules de mélanome B16-F10 exprimant Flt3L ainsi qu’une analyse phénotypique et fonctionnelle des cellules immunitaires dans le microenvironnement tumoral (TME). Les procédures pour la préparation de cellules tumorales en culture, l’implantation tumorale, l’irradiation cellulaire, la mesure de la taille de la tumeur, l’isolement des cellules immunitaires intratumorales et l’analyse de cytométrie en flux sont décrites. L’objectif global de ce protocole est de fournir un modèle préclinique d’immunothérapie des tumeurs solides et une plate-forme de recherche pour étudier la relation entre les cellules tumorales et les cellules immunitaires infiltrantes. Le protocole d’immunothérapie décrit ici peut être combiné à d’autres modalités thérapeutiques, telles que le blocage des points de contrôle immunitaires (anticorps anti-CTLA-4, anti–1, anti–L1) ou la chimiothérapie afin d’améliorer l’effet thérapeutique cancéreux du mélanome.
L’immunothérapie du cancer a été reconnue comme une stratégie thérapeutique prometteuse basée sur ses effets secondaires moins toxiques et ses réponses plus durables. Plusieurs types d’immunothérapies ont été développés, notamment les thérapies virales oncolytiques, les vaccins contre le cancer, les thérapies à base de cytokines, les anticorps monoclonaux, le transfert de cellules adoptives (cellules CAR-T ou CAR-NK) et le blocage des points de contrôle immunitaires1.
Pour les vaccins contre le cancer, il existe différentes formes de vaccins thérapeutiques, tels que les vaccins à base de cellules entières, les vaccins à base de protéines ou de peptides et les vaccins à ARN ou à ADN. La vaccination repose sur la capacité des cellules présentatrices d’antigènes (APC) à traiter les antigènes tumoraux, y compris les antigènes spécifiques de la tumeur, et à les présenter sous une forme immunogène aux lymphocytes T. Les cellules dendritiques (DC) sont connues pour être les APC les plus puissants et joueraient un rôle important dans l’immunité antitumorale 2,3. Ces cellules absorbent et traitent les antigènes tumoraux, puis migrent vers les ganglions lymphatiques drainants (dLN) pour amorcer et activer les cellules effectrices T spécifiques de la tumeur (Teff) par l’engagement du récepteur des cellules T (TCR) et des molécules costimulatrices. Il en résulte une différenciation et une expansion des cellules T cytotoxiques spécifiques à la tumeur (CTL), qui infiltrent la tumeur et tuent les cellules tumorales4. Par conséquent, l’activation et la maturation des DC représentent des stratégies attrayantes pour stimuler l’immunité contre les antigènes tumoraux.
Flt3L est connu pour favoriser la maturation et l’expansion des DC fonctionnellement matures qui expriment les protéines CMH de classe II, CD11c, DEC205 et CD865. Il a été démontré que l’administration intratumorale, mais non intraveineuse, d’un vecteur adénovirus incorporant le gène Flt3L (Adv-Flt3L) favorise l’activité thérapeutique immunitaire contre les tumeurs orthrotopiques6. Flt3L a également été utilisé dans des vaccins à base de cellules tumorales constitués de cellules B16-F10 irradiées exprimant de manière stable Flt3L transduit rétroviralement comme un moyen d’améliorer la présentation croisée des antigènes tumoraux par les DC et, par conséquent, d’augmenter les réponses antitumorales. Le protocole de vaccination contre les tumeurs B16-Flt3L décrit ici est basé sur une étude publiée par le groupe7 du Dr James Allison. Dans cet article, ils ont rapporté qu’un vaccin B16-Flt3L combiné au blocage CTLA-4 induisait de manière synergique le rejet du mélanome établi, entraînant une survie accrue.
L’objectif de ce protocole est de fournir un modèle d’immunothérapie préclinique pour le mélanome. Ici, des procédures détaillées sur la façon de préparer et d’implanter des vaccins tumoraux, et comment analyser la composition et la fonction des cellules immunitaires intratumorales à partir de tumeurs solides sont décrites.
Le protocole décrit ici est basé sur l’étude du groupe d’Allison. Ils ont démontré que la combinaison du vaccin B16-Flt3L avec le blocage CTLA-4 a montré un effet synergique sur le taux de survie et la croissance tumorale, alors qu’aucune réduction de la croissance tumorale n’a été observée chez les souris recevant le vaccin B16-Flt3L ou le traitement par anticorps anti-CTLA-4 seul7. Des études récentes ont révélé une nouvelle voie de signalisation CTLA4-PKCη intrinsèque ?…
The authors have nothing to disclose.
Nous remercions le Dr Stephen Schoenberger d’avoir fourni des cellules B16-Flt3L et le personnel des installations de cytométrie animale et de cytométrie en flux de l’INLJ pour un excellent soutien.
0.25% trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
10% heat-inactivated FBS | Omega Scientific | FB-02 | Lot# 209018 |
30G needle | BD Biosciences | 305106 | |
96 well V-shape-bottom plate | SARSTEDT | 83.3926.500 | |
B16 cell line expressing Fms-like tyrosine kinase 3 ligand (B16-Flt3L) | Gift of Dr. Stephen Schoenberger, LJI | Flt3L cDNAs were cloned into the pMG-Lyt2 retroviral vector, as in refernce 5, Supplemental Figure 1 | |
B16-F10 cell lines | ATCC | CRL-6475 | |
Centrifuge 5810R | Eppendorf | ||
Cytofix fixation buffer | BD Biosciences | BDB554655 | Cell fixation buffer (4.2% PFA) |
Cytofix/Cytoperm kit | BD Biosciences | 554714 | Fixation/Permeabilization Solution Kit |
DNase I | Sigma | 11284932001 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Corning | 10013CV | |
Electronic digital caliper | Fisherbrand | 14-648-17 | |
FlowJo software | Tree Star | Flow cytometer data analysis | |
GolgiStop (protein transport inhibitor) | BD Biosciences | 554724 | 1:1500 dilution |
HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
Ionomycin | Sigma | I0634 | |
Iscove’s modified Dulbecco’s medium (IMDM) | Thermo Fisher | 12440053 | |
LSR-II cytometers | BD Biosciences | Flow cytometer | |
MEM nonessential amino acids | Gibco | 11140-050 | |
penicillin and streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
Percoll | GE Healthcare Life Sciences | GE17-0891-02 | density gradient specific medium |
PMA | Sigma | P1585 | |
Red Blood Cell Lysing Buffer Hybri-Max liquid | Sigma | R7757-100ML | |
RPMI 1640 medium | Corning | 10-040-CV | |
RS2000 X-ray Irradiator | Rad Source Technologies | ||
sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
Sterile cell strainer 40 μm | Fisherbrand | 22-363-547 | |
Sterile cell strainer 70 μm | Fisherbrand | 22-363-548 | |
TL Liberase | Roche | 477530 | |
Zombie Aqua fixable viability kit | BioLegend | 423101 | |
Antibodies | |||
Anti-mCD45 | BioLegend | 103135 | Clone: 30-F11 Fluorophore: BV570 Dilution: 1:200 |
Anti-mCD3ε | BioLegend | 100327 | Clone: 145-2C11 Fluorophore: PerCP-Cy5.5 Dilution: 1:200 |
Anti-mCD8 | BioLegend | 100730 100724 |
Clone: 53-6.7 Fluorophore: Alexa Fluor 700, Alexa Fluor 647 Dilution: 1:200 |
Anti-mCD4 | BioLegend | 100414 | Clone: GK1.5 Fluorophore: APC-Cy7 Dilution: 1:200 |
Anti-mFoxp3 | Thermo Fisher Scientific | 11577382 | Clone: FJK-16s Fluorophore: FITC Dilution: 1:100 |
Anti-m/hGzmB | BioLegend | 372208 | Clone: QA16A02 Fluorophore: PE Dilution: 1:100 |
Anti-mIFNg | BioLegend | 505826 | Clone: XMG1.2 Fluorophore: PE-Cy7 Dilution: 1:100 |
Anti-mCD19 | BioLegend | 115543 | Clone: 6D5 Fluorophore: BV785 Dilution: 1:100 |
Anti-mGr1 | BioLegend | 108423 | Clone: RB6-8C5 Fluorophore: APC/Cy7 Dilution: 1:200 |
Anti-mCD11b | BioLegend | 101223 | Clone: M1/70 Fluorophore: Pacific blue Dilution: 1:100 |
Anti-mF4/80 | BioLegend | 123114 | Clone: BM8 Fluorophore: PECy7 Dilution: 1:100 |
Anti-mCD11c | BioLegend | 117328 | Clone: N418 Fluorophore: PerCP Cy5.5 Dilution: 1:100 |
Anti-mMHCII | BioLegend | 107622 | Clone: M5/114.15.2 Fluorophore: AF700 Dilution: 1:400 |
Anti-mCD103 | BioLegend | 121410 | Clone: 2E7 Fluorophore: Alexa Fluor 647 Dilution: 1:200 |
Anti-mCD86 | BioLegend | 105007 | Clone: GL-1 Fluorophore: PE Dilution: 1:200 |
FC-blocker (Rat anti-mouse CD16/CD32) | BD Biosciences | 553141 | Clone: 2.4G2 Dilution: 1:200 |