消化管は、放射線治療によるがん治療の損傷に対して最も敏感な臓器の1つです。それは同時に、そのような侮辱に続く最高の再生能力の1つを持つ臓器系です。提示されたプロトコルは、腸上皮の再生能力を研究するための効率的な方法を記載している。
腸上皮は単層の細胞で構成されていますが、腸管陰窩の底にある腸幹細胞の活発な増殖によって生成される複数の種類の最終分化細胞が含まれています。しかし、急性腸損傷のイベント中に、これらの活性腸幹細胞は細胞死を受けます。ガンマ線照射は広く使用されている結腸直腸癌治療であり、治療的には有効であるが、活性幹細胞プールを枯渇させる副作用がある。実際、患者は放射線療法を受けている間に胃腸放射線症候群を頻繁に経験しますが、これは一部には活発な幹細胞の枯渇によるものです。腸陰窩における活性腸幹細胞の喪失は、典型的には静止している予備腸幹細胞のプールを活性化し、分泌細胞および腸細胞前駆細胞の脱分化を誘導する。これらの細胞がなければ、腸上皮は放射線療法や他のそのような主要な組織傷害から回復する能力を欠いているでしょう。系統追跡技術の新たな進歩により、再生中の細胞の活性化、分化、および移動の追跡が可能になり、腸内でのこれを研究するために首尾よく採用されています。本研究は、放射線障害後のマウス腸管上皮内の細胞を解析する方法を示すことを目的とする。
ヒトの腸管上皮は、完全に平らに配置すると、バドミントンコートの表面のほぼ半分を覆います1。代わりに、人間を腸の内容物から分離するこの単一細胞層は、一連の指のような突起、絨毛、およびくぼみ、腸の表面積を最大化する陰窩に圧縮されます。上皮の細胞は陰窩 – 絨毛軸に沿って分化する。絨毛は主に栄養吸収腸細胞、粘液分泌杯細胞、およびホルモン産生腸内分泌細胞で構成され、陰窩は主にディフェンシン産生パネス細胞、活性および予備幹細胞、および前駆細胞2,3,4,5で構成されています。さらに、これらの細胞が下にある間葉系コンパートメントの間質細胞および免疫細胞および内腔の微生物叢との双方向の通信は、腸の恒常性を維持する相互作用の複雑なネットワークを生成し、損傷後の回復に不可欠です6,7,8。
腸上皮は人体で最も急速に自己再生する組織であり、代謝回転率は2〜6日です9,10,11。恒常性の間、ロイシンリッチリピート含有Gタンパク質共役受容体5(LGR5)の発現によって特徴付けられる腸陰窩の基部(陰窩基底柱状細胞)の活性幹細胞は急速に分裂し、他のすべての腸上皮系譜に分化する前駆細胞を提供する。しかし、有糸分裂率が高いため、活性幹細胞とその直接の前駆細胞はガンマ線損傷に特に敏感であり、照射後にアポトーシスを起こします5,12,13,14。それらが失われると、腸陰窩内の予備幹細胞および非幹細胞(前駆細胞の亜集団およびいくつかの最終分化細胞)が活性化され、基底陰窩コンパートメントを補充し、絨毛の細胞集団を再構成し、したがって腸上皮を再生することができる15。系統追跡技術を用いて、複数の研究グループは、予備(静止)幹細胞が活性幹細胞の喪失時の再生をサポートできることを実証している13、16、17、18、19、20、21、22。これらの細胞は、ポリコーム複合体タンパク質1癌遺伝子(Bmi1)、マウステロメラーゼ逆転写酵素遺伝子(mTert)、ホップホメオボックス(Hopx)、およびロイシンリッチリピートタンパク質1遺伝子(Lrig1)の存在によって特徴付けられる。さらに、非幹細胞は、損傷時に腸陰窩を補充することができることが示されている23、24、25、26、27、28、29、30、31。特に、分泌細胞や腸細胞の前駆細胞は、傷害時に脱分化を起こし、幹細胞様細胞に戻り、腸上皮の再生をサポートすることが示されています。最近の研究では、損傷時にステムのような特徴を獲得する能力を持つ複数のマーカー(DLL+、ATOH1+、PROX1+、MIST1+、DCLK1+など)32,33,34,35,36を発現する細胞が同定されています。驚くべきことに、Yuらは、成熟したPaneth細胞(LYZ+)でさえ腸の再生に寄与し得ることを示した37。さらに、腸上皮細胞のアポトーシスを引き起こし、上皮バリア機能を破壊することに加えて、照射は腸内細菌叢の嚥下障害、免疫細胞の活性化および炎症誘発性応答の開始、ならびに間葉系および間質細胞の活性化をもたらす38,39。
ガンマ線は、特に結腸直腸腫瘍の場合、癌治療における貴重な治療ツールです40。しかし、照射は細胞にダメージを与えることで腸の恒常性に大きく影響し、アポトーシスにつながります。放射線被曝は、患者の回復を遅らせる複数の摂動を引き起こし、急性期の粘膜損傷と炎症、および長期的に下痢、失禁、出血、腹痛を特徴としています。この症状の広がりは、胃腸放射線毒性と呼ばれます。さらに、経壁線維症および/または血管硬化症の放射線誘発性の進行は、治療後数年でのみ現れる可能性があります38,41。損傷自体と同時に、放射線は腸細胞の修復応答を誘導し、再生の開始と調整に関与するシグナル伝達経路を活性化します42。放射線誘発性小腸疾患は、他の臓器(子宮頸部、前立腺、膵臓、直腸など)に提供される骨盤または腹部の放射線療法に起因する可能性があります41、43、44、45、46。したがって、腸管照射損傷は重要な臨床的問題であり、結果として生じる病態生理学のより良い理解は、放射線療法に関連する胃腸合併症を軽減するための介入の開発を進める可能性があります。放射線とは別に、腸上皮の再生目的を調査することを可能にする他の技術があります。炎症およびその後の再生を研究するためのトランスジェニックおよびケミカルマウスモデルが開発されている47。デキストラン硫酸ナトリウム(DSS)は腸に炎症を誘発し、炎症性腸疾患と同様の特徴を発達させます48。発がん性化合物アゾキシメタン(AOM)とDSS治療の組み合わせは、大腸炎関連癌の発症をもたらす可能性があります48,49。虚血再灌流誘発傷害は、腸上皮の再生能力を研究するために採用される別の方法である。この技術には経験と外科的知識が必要です50。さらに、前述の技術は放射線とは異なるタイプの傷害を引き起こし、再生の異なるメカニズムの関与につながる可能性があります。さらに、これらのモデルは時間がかかりますが、放射線技術はかなり短いです。最近、腸および結腸から生成されたエンテロイドおよびコロノイドを利用するin vitro法が、腸管再生のメカニズムを研究するために放射線障害と組み合わせて使用 されている51,52。ただし、これらの手法は、モデル53,54の臓器を完全には再現していません。
提示されたプロトコルには、タモキシフェン治療後に予備幹細胞集団に由来する系統の追跡を可能にする遺伝子モデルと組み合わせたガンマ線損傷のマウスモデルの説明が含まれています(Bmi1-CreER;Rosa26eYFP)。このモデルは、12Gy全身照射を利用しており、予備の幹細胞を活性化するのに十分な有意な腸損傷を誘発すると同時に、損傷から7日以内に腸の再生能力のその後の調査を可能にします55。
このプロトコルは、堅牢で再現性のある放射線障害モデルを記述します。これにより、損傷後7日間の腸上皮の変化を正確に分析することができます。重要なことに、選択された時点は損傷の重要な段階を反映しており、腸への明確な変化(損傷、アポトーシス、再生、および正常化段階)によって特徴付けられます60。この照射モデルは確立され、注意深く評価されており、?…
The authors have nothing to disclose.
著者らは、組織標本の準備に関する専門家の支援についてはストーニーブルックがんセンター組織学研究コア、動物の世話と取り扱いを支援するストーニーブルック大学の実験動物資源部門に感謝したいと思います。この研究は、国立衛生研究所からの助成金によって支援されました DK124342 Agnieszka B. Bialkowskaに授与され、DK052230からVincent W. Yang博士に授与されました。
1 mL syringe | BD | 309659 | – |
16G Reusable Small Animal Feeding Needles: Straight | VWR | 20068-630 | – |
27G x 1/2" needle | BD | 305109 | – |
28G x 1/2" Monoject 1mL insulin syringe | Covidien | 1188128012 | – |
5-Ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU) | Santa Cruz Biotechnology | sc284628A | 10 mg/mL in sterile DMSO:water (1:4 v/v), aliquot and store in -20°C |
Azer Scientific 10% Neutral Buffered Formalin | Fisher Scientific | 22-026-213 | – |
B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J | The Jackson Laboratory | Strain #:006148 | |
B6;129-Bmi1tm1(cre/ERT)Mrc/J | The Jackson Laboratory | Strain #:010531 | |
Bovine Serum Albumin Fraction V, heat shock | Millipore-Sigma | 3116956001 | |
Chicken anti-GFP | Aves | GFP-1020 | |
Click-IT plus EdU Alexa Fluor 555 imaging kit, Invitrogen | Thermo Fisher Scientific | C10638 | – |
Corn oil | Millipore-Sigma | C8267 | – |
Decloaking Chamber | Biocare Medical | DC2012 | – |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher BioReagents | BP231-100 | light sensitive |
DNase-free proteinase K | Invitrogen | C10618H | diluted 25x in DPBS |
Donkey anti-chicken AF647 | Jackson ImmunoResearch | 703-605-155 | |
DPBS | Fisher Scientific | 21-031-CV | – |
Eosin | Fisher Scientific | S176 | |
Fluorescence Microscope Nikon Eclipse 90i Bright and fluoerescent light, with objectives: 10X, 20X | Nikon | ||
Fluoromount Aqueous Mounting Medium | Millipore-Sigma | F4680-25ML | |
Gamma Cell 40 Exactor | Best Theratronics Ltd. | – | 0.759 Gy min-1 |
Goat anti-rabbit AF488 | Jackson ImmunoResearch | 111-545-144 | |
Hematoxylin Solution, Gill No. 3 | Millipore-Sigma | GHS332 | |
HM 325 Rotary Microtome from Thermo Scientific | Fisher Scientific | 23-900-668 | |
Hoechst 33258, Pentahydrate (bis-Benzimide) | Thermo Fisher Scientific | H3569 | dilution 1:1000 |
Hydrogen Peroxide Solution, ACS, 29-32%, Spectrum Chemical | Fisher Scientific | 18-603-252 | – |
In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein (Roche) | Millipore-Sigma | 11684795910 | |
Liquid Blocker Super PAP PEN, Mini | Fisher Scientific | DAI-PAP-S-M | |
Lithium Carbonate (Powder/Certified ACS), Fisher Chemical | Fisher Scientific | L119-500 | 0.5g/1L dH2O |
Luer-Lok Syringe sterile, single use, 10 mL | VWR | 89215-218 | – |
Methanol | VWR | BDH1135-4LP | |
Pharmco Products Ethyl alcohol, 200 PROOF | Fisher Scientific | NC1675398 | – |
Pharmco-Aaper 281000ACSCSLT Acetic Acid ACS Grade | Capitol Scientific | AAP-281000ACSCSLT | – |
Rabbit anti-Ki67 | BioCare Medical | CRM325 | |
Richard-Allan Scientific Cytoseal XYL Mounting Medium | Fisher Scientific | 22-050-262 | |
Scientific Industries Incubator-Genie for baking slides at 65 degree | Fisher Scientific | 50-728-103 | |
Sodium Citrate Dihydrate | Fisher Scientific | S279-500 | |
Stainless Steel Dissecting Kit | VWR | 25640-002 | |
Superfrost Plus micro slides [size: 25 x 75 x 1 mm] | VWR | 48311-703 | |
Tamoxifen | Millipore-Sigma | T5648 | 30 mg/mL in sterile corn oil, preferably fresh or short-sterm storage in -20°C, light sensitive |
Tissue-Tek 24-Slide Holders with Detachable Handle | Sakura | 4465 | |
Tissue-Tek Accu-Edge Low Profile Blades | Sakura | 4689 | |
Tissue-Tek Manual Slide Staining Set | Sakura | 4451 | |
Tissue-Tek Staining Dish, Green with Lid | Sakura | 4456 | |
Tissue-Tek Staining Dish, White with Lid | Sakura | 4457 | |
Tween 20 | Millipore-Sigma | P7949 | |
Unisette Processing Cassettes | VWR | 87002-292 | – |
VWR Micro Cover Glasses | VWR | 48393-081 | |
Xylene | Fisher Scientific | X5P-1GAL |