الجهاز الهضمي هو واحد من أكثر الأعضاء حساسية للإصابة عند علاجات السرطان الإشعاعية. إنه في نفس الوقت نظام عضوي يتمتع بواحدة من أعلى قدرات التجدد بعد مثل هذه الإهانات. يصف البروتوكول المقدم طريقة فعالة لدراسة القدرة التجديدية للظهارة المعوية.
تتكون ظهارة الأمعاء من طبقة واحدة من الخلايا ولكنها تحتوي على أنواع متعددة من الخلايا المتمايزة نهائيا ، والتي يتم إنشاؤها عن طريق الانتشار النشط للخلايا الجذعية المعوية الموجودة في الجزء السفلي من الخبايا المعوية. ومع ذلك ، خلال أحداث الإصابة المعوية الحادة ، تخضع هذه الخلايا الجذعية المعوية النشطة لموت الخلايا. تشعيع جاما هو علاج لسرطان القولون والمستقيم يستخدم على نطاق واسع ، والذي ، على الرغم من فعاليته العلاجية ، له تأثير جانبي يتمثل في استنفاد تجمع الخلايا الجذعية النشط. في الواقع ، يعاني المرضى في كثير من الأحيان من متلازمة الإشعاع المعدي المعوي أثناء خضوعهم للعلاج الإشعاعي ، ويرجع ذلك جزئيا إلى نضوب الخلايا الجذعية النشطة. يؤدي فقدان الخلايا الجذعية المعوية النشطة في الخبايا المعوية إلى تنشيط مجموعة من الخلايا الجذعية المعوية الاحتياطية الهادئة عادة ويؤدي إلى إلغاء تمايز الخلايا الأولية الإفرازية والخلايا المعوية. إن لم يكن لهذه الخلايا ، فإن ظهارة الأمعاء ستفتقر إلى القدرة على التعافي من العلاج الإشعاعي وغيرها من الإهانات الأنسجة الرئيسية. تسمح التطورات الجديدة في تقنيات تتبع النسب بتتبع تنشيط الخلايا وتمايزها وهجرتها أثناء التجديد وقد تم استخدامها بنجاح لدراسة ذلك في القناة الهضمية. تهدف هذه الدراسة إلى تصوير طريقة لتحليل الخلايا داخل ظهارة الأمعاء للفأر بعد الإصابة الإشعاعية.
ستغطي ظهارة الأمعاء البشرية سطح نصف ملعب كرة الريشة تقريبا إذا تم وضعها بشكل مسطح تماما1. بدلا من ذلك ، يتم ضغط طبقة الخلية المفردة هذه التي تفصل البشر عن محتويات أمعائهم في سلسلة من الإسقاطات الشبيهة بالأصابع ، والزغابات ، والمسافات البادئة ، وهي خبايا تزيد من مساحة سطح الأمعاء. تتمايز خلايا الظهارة على طول محور الزغابات المشفرة. تتكون الزغابات بشكل أساسي من الخلايا المعوية الممتصة للمغذيات ، والخلايا الكأسية المفرزة للمخاط ، وخلايا الغدد الصماء المعوية المنتجة للهرمونات ، بينما تتكون الخبايا بشكل أساسي من خلايا بانيث المنتجة للدفاع ، والخلايا الجذعية النشطة والاحتياطية ، والخلايا السلفية2،3،4،5. علاوة على ذلك ، فإن الاتصال ثنائي الاتجاه الذي تمتلكه هذه الخلايا مع الخلايا اللحمية والخلايا المناعية للمقصورة الوسيطة الأساسية والميكروبات في التجويف يولد شبكة معقدة من التفاعلات التي تحافظ على توازن الأمعاء وهي ضرورية للتعافي بعد الإصابة6،7،8.
ظهارة الأمعاء هي أسرع الأنسجة ذاتية التجدد في جسم الإنسان ، بمعدل دوران 2-6 أيام9،10،11. أثناء الاتزان الداخلي ، تنقسم الخلايا الجذعية النشطة في قاعدة الخبايا المعوية (الخلايا العمودية ذات القاعدة القبية) ، والتي تتميز بالتعبير عن مستقبلات البروتين G المقترنة 5 (LGR5) الغنية بالليوسين المحتوية على التكرار ، بسرعة وتوفر الخلايا السلفية التي تتمايز إلى جميع السلالات الظهارية المعوية الأخرى. ومع ذلك ، نظرا لارتفاع معدل الانقسام ، فإن الخلايا الجذعية النشطة وأسلافها المباشرين حساسون بشكل خاص لإصابة أشعة جاما ويخضعون لموت الخلايا المبرمج بعد التشعيع5،12،13،14. عند فقدانها ، تخضع الخلايا الجذعية الاحتياطية والخلايا غير الجذعية (السكان الفرعي للأسلاف وبعض الخلايا المتمايزة نهائيا) داخل الخبايا المعوية للتنشيط وتجديد حجرة القبو القاعدية ، والتي يمكنها بعد ذلك إعادة تكوين مجموعات خلايا الزغابات ، وبالتالي تجديد ظهارة الأمعاء15. باستخدام تقنيات تتبع النسب ، أثبتت مجموعات بحثية متعددة أن الخلايا الجذعية الاحتياطية (الهادئة) قادرة على دعم التجدد عند فقدان الخلايا الجذعية النشطة13،16،17،18،19،20،21،22. تتميز هذه الخلايا بوجود جين البروتين المركب متعدد المشبك 1 (Bmi1) ، وجين النسخ العكسي تيلوميراز الفأر (mTert) ، و Hop homeobox (Hopx) ، وجين البروتين المتكرر الغني بالليوسين 1 (Lrig1). بالإضافة إلى ذلك ، فقد ثبت أن الخلايا غير الجذعية قادرة على تجديد الخبايا المعوية عند الإصابة 23،24،25،26،27،28،29،30،31. على وجه الخصوص ، فقد ثبت أن أسلاف الخلايا الإفرازية والخلايا المعوية تخضع لفك التمايز عند الإصابة ، والعودة إلى الخلايا الشبيهة بالجذعية ، ودعم تجديد ظهارة الأمعاء. حددت الدراسات الحديثة الخلايا التي تعبر عن علامات متعددة تمتلك القدرة على اكتساب خصائص تشبه الساق عند الإصابة (مثل DLL + و ATOH1 + و PROX1 + و MIST1 + و DCLK1 +) 32،33،34،35،36. والمثير للدهشة أن Yu et al. أظهر أنه حتى خلايا Paneth الناضجة (LYZ +) يمكن أن تساهم في تجديد الأمعاء37. علاوة على ذلك ، بالإضافة إلى التسبب في موت الخلايا المبرمج للخلايا الظهارية المعوية وتعطيل وظيفة الحاجز الظهاري ، يؤدي التشعيع إلى dysbiosis من النباتات المعوية ، وتنشيط الخلايا المناعية وبدء استجابة مؤيدة للالتهابات ، وتفعيل الخلايا الوسيطة واللحمية38,39.
يعد إشعاع جاما أداة علاجية قيمة في علاج السرطان ، خاصة بالنسبة لأورام القولون والمستقيم40. ومع ذلك ، يؤثر التشعيع بشكل كبير على التوازن المعوي عن طريق إحداث تلف في الخلايا ، مما يؤدي إلى موت الخلايا المبرمج. يسبب التعرض للإشعاع اضطرابات متعددة تبطئ تعافي المريض وتتميز بإصابة الغشاء المخاطي والالتهاب في المرحلة الحادة والإسهال وسلس البول والنزيف وآلام البطن على المدى الطويل. يشار إلى هذه المجموعة من المظاهر باسم سمية الإشعاع المعدي المعوي. بالإضافة إلى ذلك ، قد يظهر تطور التليف عبر الفم و / أو التصلب الوعائي الناجم عن الإشعاع بعد سنوات فقط من العلاج38,41. بالتزامن مع الإصابة نفسها ، يحفز الإشعاع استجابة إصلاح في الخلايا المعوية التي تنشط مسارات الإشارات المسؤولة عن بدء التجديد وتنظيمه42. يمكن أن ينشأ مرض الأمعاء الدقيقة الناجم عن الإشعاع من العلاج الإشعاعي للحوض أو البطن المقدم إلى أعضاء أخرى (مثل عنق الرحم والبروستاتا والبنكرياس والمستقيم)41،43،44،45،46. وبالتالي ، فإن إصابة التشعيع المعوي هي مشكلة سريرية كبيرة ، ومن المرجح أن يؤدي الفهم الأفضل للفيزيولوجيا المرضية الناتجة إلى تعزيز تطوير التدخلات للتخفيف من مضاعفات الجهاز الهضمي المرتبطة بالعلاج الإشعاعي. هناك تقنيات أخرى تسمح بالتحقيق في الغرض التجديدي لظهارة الأمعاء بصرف النظر عن الإشعاع. تم تطوير نماذج الفئران المعدلة وراثيا والكيميائية لدراسة الالتهاب والتجديد بعدذلك 47. كبريتات الصوديوم ديكستران (DSS) يحفز التهاب في الأمعاء ويؤدي إلى تطوير خصائص مماثلة لتلك الخاصة بمرض التهاب الأمعاء48. يمكن أن يؤدي الجمع بين علاج DSS والمركب المؤيد للسرطان azoxymethane (AOM) إلى تطور السرطان المرتبط بالتهاب القولون48,49. الإصابة الناجمة عن نقص التروية هي طريقة أخرى تستخدم لدراسة الإمكانات التجديدية للظهارة المعوية. هذه التقنية تتطلب الخبرة والمعرفة الجراحية50. علاوة على ذلك ، تسبب التقنيات المذكورة أعلاه أنواعا مختلفة من الإصابات عن الإشعاع وقد تؤدي إلى إشراك آليات مختلفة للتجديد. بالإضافة إلى ذلك ، فإن هذه النماذج تستغرق وقتا طويلا ، في حين أن تقنية الإشعاع قصيرة إلى حد ما. في الآونة الأخيرة ، تم استخدام طرق في المختبر باستخدام enteroids والقولون المتولدة من الأمعاء والقولون في تركيبة مع إصابة الإشعاع لدراسة آليات تجديد الأمعاء51,52. ومع ذلك ، فإن هذه التقنيات لا تلخص بشكل كامل العضو الذي نمذجته53,54.
ويتضمن البروتوكول المقدم وصفا لنموذج الفئران لإصابة أشعة غاما بالاقتران مع نموذج جيني يسمح بعد معالجة عقار تاموكسيفين بتتبع السلالات الناشئة عن تجمعات الخلايا الجذعية الاحتياطية (Bmi1-CreER; Rosa26eYFP). يستخدم هذا النموذج تشعيع الجسم الكلي 12 جراي ، مما يؤدي إلى إصابة معوية كبيرة بما يكفي لتنشيط الخلايا الجذعية الاحتياطية مع السماح بالتحقيق اللاحق في القدرة على التجدد المعوي في غضون 7 أيام من الإصابة55.
يصف هذا البروتوكول نموذجا قويا وقابلا للتكرار للإصابة الإشعاعية. يسمح بالتحليل الدقيق للتغيرات في ظهارة الأمعاء على مدار 7 أيام بعد الإصابة. الأهم من ذلك ، أن النقاط الزمنية المختارة تعكس المراحل الحاسمة من الإصابة وتتميز بتغيرات مميزة في الأمعاء (الإصابة ، موت الخلايا المبرمج ، التجديد ?…
The authors have nothing to disclose.
يرغب المؤلفون في الاعتراف بمركز أبحاث الأنسجة في مركز ستوني بروك للسرطان للحصول على مساعدة الخبراء في إعداد عينات الأنسجة وقسم الموارد الحيوانية المختبرية في جامعة ستوني بروك للمساعدة في رعاية الحيوانات والتعامل معها. تم دعم هذا العمل بمنح من المعاهد الوطنية للصحة DK124342 الممنوحة ل Agnieszka B. Bialkowska و DK052230 للدكتور فنسنت دبليو يانغ.
1 mL syringe | BD | 309659 | – |
16G Reusable Small Animal Feeding Needles: Straight | VWR | 20068-630 | – |
27G x 1/2" needle | BD | 305109 | – |
28G x 1/2" Monoject 1mL insulin syringe | Covidien | 1188128012 | – |
5-Ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU) | Santa Cruz Biotechnology | sc284628A | 10 mg/mL in sterile DMSO:water (1:4 v/v), aliquot and store in -20°C |
Azer Scientific 10% Neutral Buffered Formalin | Fisher Scientific | 22-026-213 | – |
B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J | The Jackson Laboratory | Strain #:006148 | |
B6;129-Bmi1tm1(cre/ERT)Mrc/J | The Jackson Laboratory | Strain #:010531 | |
Bovine Serum Albumin Fraction V, heat shock | Millipore-Sigma | 3116956001 | |
Chicken anti-GFP | Aves | GFP-1020 | |
Click-IT plus EdU Alexa Fluor 555 imaging kit, Invitrogen | Thermo Fisher Scientific | C10638 | – |
Corn oil | Millipore-Sigma | C8267 | – |
Decloaking Chamber | Biocare Medical | DC2012 | – |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher BioReagents | BP231-100 | light sensitive |
DNase-free proteinase K | Invitrogen | C10618H | diluted 25x in DPBS |
Donkey anti-chicken AF647 | Jackson ImmunoResearch | 703-605-155 | |
DPBS | Fisher Scientific | 21-031-CV | – |
Eosin | Fisher Scientific | S176 | |
Fluorescence Microscope Nikon Eclipse 90i Bright and fluoerescent light, with objectives: 10X, 20X | Nikon | ||
Fluoromount Aqueous Mounting Medium | Millipore-Sigma | F4680-25ML | |
Gamma Cell 40 Exactor | Best Theratronics Ltd. | – | 0.759 Gy min-1 |
Goat anti-rabbit AF488 | Jackson ImmunoResearch | 111-545-144 | |
Hematoxylin Solution, Gill No. 3 | Millipore-Sigma | GHS332 | |
HM 325 Rotary Microtome from Thermo Scientific | Fisher Scientific | 23-900-668 | |
Hoechst 33258, Pentahydrate (bis-Benzimide) | Thermo Fisher Scientific | H3569 | dilution 1:1000 |
Hydrogen Peroxide Solution, ACS, 29-32%, Spectrum Chemical | Fisher Scientific | 18-603-252 | – |
In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein (Roche) | Millipore-Sigma | 11684795910 | |
Liquid Blocker Super PAP PEN, Mini | Fisher Scientific | DAI-PAP-S-M | |
Lithium Carbonate (Powder/Certified ACS), Fisher Chemical | Fisher Scientific | L119-500 | 0.5g/1L dH2O |
Luer-Lok Syringe sterile, single use, 10 mL | VWR | 89215-218 | – |
Methanol | VWR | BDH1135-4LP | |
Pharmco Products Ethyl alcohol, 200 PROOF | Fisher Scientific | NC1675398 | – |
Pharmco-Aaper 281000ACSCSLT Acetic Acid ACS Grade | Capitol Scientific | AAP-281000ACSCSLT | – |
Rabbit anti-Ki67 | BioCare Medical | CRM325 | |
Richard-Allan Scientific Cytoseal XYL Mounting Medium | Fisher Scientific | 22-050-262 | |
Scientific Industries Incubator-Genie for baking slides at 65 degree | Fisher Scientific | 50-728-103 | |
Sodium Citrate Dihydrate | Fisher Scientific | S279-500 | |
Stainless Steel Dissecting Kit | VWR | 25640-002 | |
Superfrost Plus micro slides [size: 25 x 75 x 1 mm] | VWR | 48311-703 | |
Tamoxifen | Millipore-Sigma | T5648 | 30 mg/mL in sterile corn oil, preferably fresh or short-sterm storage in -20°C, light sensitive |
Tissue-Tek 24-Slide Holders with Detachable Handle | Sakura | 4465 | |
Tissue-Tek Accu-Edge Low Profile Blades | Sakura | 4689 | |
Tissue-Tek Manual Slide Staining Set | Sakura | 4451 | |
Tissue-Tek Staining Dish, Green with Lid | Sakura | 4456 | |
Tissue-Tek Staining Dish, White with Lid | Sakura | 4457 | |
Tween 20 | Millipore-Sigma | P7949 | |
Unisette Processing Cassettes | VWR | 87002-292 | – |
VWR Micro Cover Glasses | VWR | 48393-081 | |
Xylene | Fisher Scientific | X5P-1GAL |