細胞外細菌やオルセーウイルスや微胞子虫(真菌)などの細胞内病原体を含む腸内微生物は、野生の カエノラブディティス 線虫と関連していることがよくあります。この記事では、 C.エレガンス 線虫にコロニー形成および/または感染する微生物を検出および定量化するためのプロトコルを提示し、実験室で制御された感染後の病原体負荷を測定します。
野生の カエノラブディティス 線虫の腸には、腸内細菌叢細菌や微胞子虫やウイルスなどの病原体など、さまざまな微生物が生息しています。 カエノラブディティス・エレガンスと 哺乳類の腸細胞の類似性、および C.エレガンス システムの力により、この宿主は宿主の腸と微生物の相互作用を in vivoで研究するためのモデルシステムとして浮上しています。明視野顕微鏡でこれらの相互作用のいくつかの側面を観察することは可能ですが、より正確なツールなしで微生物を正確に分類し、コロニー形成または感染の程度を特徴付けることは困難です。RNA蛍光 in situ ハイブリダイゼーション(FISH)は、野生の線虫中の微生物を同定および視覚化するためのツールとして、または実験室で微生物に感染した線虫の感染を実験的に特徴付けおよび定量化するためのツールとして使用できます。FISHプローブは、非常に豊富な低サブユニットリボソームRNAを標識し、細菌および小胞子体細胞に対して明るいシグナルを生成します。多くの種に共通するリボソームRNAの保存領域を標的とするように設計されたプローブは、広範囲の微生物を検出できますが、リボソームRNAの異なる領域を標的とするプローブは、より狭い検出に役立ちます。同様に、プローブは、ウイルスRNAを標識するように設計することができる。パラホルムアルデヒド(PFA)またはアセトン固定のいずれかによるRNA FISH染色のプロトコルが提示されています。PFA固定は細菌、微胞子虫、ウイルスに関連する線虫に最適ですが、アセトン固定は小胞子胞子の可視化に必要です。動物を最初に洗浄し、パラホルムアルデヒドまたはアセトンで固定した。固定後、FISHプローブをサンプルと共にインキュベートして、所望の標的へのプローブのハイブリダイゼーションを可能にした。動物を再び洗浄し、次いで顕微鏡スライド上でまたは自動化されたアプローチを用いて検査した。全体として、このFISHプロトコルは、利用可能な遺伝的ツールがない微生物を含む、 C.エレガンス 腸に生息する微生物の検出、同定、および定量を可能にします。
Caenorhabditis elegansは、腸上皮細胞における自然免疫および宿主-微生物相互作用を研究するための強力なモデルシステムとして浮上しています1,2。透明な体とわずか20個の腸細胞を有するため、C.エレガンスは、無傷の生物の状況における微生物の腸のコロニー形成および感染の過程を監視するための便利なシステムを表す。線虫の腸細胞は、哺乳類の腸管上皮細胞と複数の形態学的および機能的類似性を共有しているため、微生物叢のコロニー形成と病原体感染を支配するプロセスの解剖のための扱いやすいin vivoモデルとなっています3,4,5,6。
野生のC.エレガンスは、腸にコロニーを形成して感染するさまざまな微生物を食べ、これらの線虫のサンプリングにより、この宿主に自然に関連するウイルス、真核生物(真菌、卵菌)、および細菌が発見されました7,8,9,10。オルセーウイルスは腸に感染していることが判明し、現在C.エレガンス9の唯一の既知の天然ウイルスです。微胞子虫は、野生のカエノラブディティスで最も一般的に見られる感染症である真菌関連の偏性細胞内病原体であり、いくつかの種がC.エレガンスおよび関連する線虫に感染することが発見されています8,11。野生のC.エレガンスの腸管腔には多くの細菌が生息しており、C.エレガンスマイクロバイオーム(CeMbio)の自然モデルとしていくつかの種が確立されています6,12,13,14。C.エレガンスに自然にコロニー形成および/または感染する微生物の発見と特性評価は、これらの宿主と微生物の相互作用を支配する遺伝的メカニズムを理解し、無傷の宿主動物の状況でのみ発生する新しい微生物プロセスを視覚化するために不可欠です。
サンプリング後、野生線虫を微分干渉コントラスト(DIC)顕微鏡でスクリーニングし、感染またはコロニー形成を示す表現型を探します。例えば、腸細胞の定型顆粒化外観の変化は、細胞内寄生虫感染の存在と関連し得る8。具体的には、腸顆粒の喪失と細胞質粘性の低下はウイルス感染の兆候ですが、腸顆粒の「溝」への再編成は、線虫属の微胞子虫による感染を示している可能性があります8,9。野生のC.エレガンスサンプルには多種多様な微生物が存在するため、DIC顕微鏡で微生物を区別することは困難です。宿主内の微生物の空間分布に関する情報も、多くの微生物のサイズが小さいため、検出が困難な場合があります15。さらに、目的の特定の微生物をin vitroで培養することが常に可能であるとは限らず、検出および/または定量が困難になります。
RNA蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)は、固定細胞内の小リボソームサブユニット(SSU)のRNAに結合する蛍光プローブを利用して、微生物を蛍光標識する方法を提供します。形態学的特徴の分析が特定のクラスの微生物を示唆する場合、そのような微生物の特定または広いクラスを標的とするFISHプローブを使用することができる。例えば、EUB338は、細菌SSUのための普遍的なプローブと考えられており、広範囲の細菌16を検出するために一般的に使用されている。ここで説明するプロトコルは、蛍光色素で末端標識され、目的の微生物の標的SSUに相補的になるように特別に設計された一本鎖DNAプローブを使用しますが、以前に設計されたプローブが利用可能です16。微生物のSSUを標的とする主な利点は、このRNAが比較的豊富に存在することであり、これは通常、細胞内のすべてのRNAの80%〜90%を含み、非常に高いS/N比で染色することにつながります17。プローブは、ウイルスが活発に複製している場合、感染した細胞内で非常に高いコピーで存在することが多いOrsayウイルス9,18のようなウイルスを検出するためにRNAを標的とするように設計することもできます。
既知のプローブの結果によっては、in situでの種確認のために、より特異的なプローブを設計するために、さらなる配列情報を取得する必要があるかもしれません。一般的なアプローチは、SSUの保存領域(細菌の場合は16S、真核生物の場合は18S)に対してユニバーサルプライマーを使用して、より発散する領域を(PCRを介して)増幅することです8。この配列情報を用いて、より種特異性を有するプローブを設計することができる。これらのFISHプローブは、培養に依存しない方法で微生物の同定を可能にすることができる8。さらに、RNA FISHは、フィラメント形成または組織局在パターンを含む、独特の形態学的コロニー形成および感染特性に関する洞察を与えることができる19,20。異なる色のFISHプローブを同時に使用することができ、野生線虫サンプル中の微生物間の視覚的区別、ならびに宿主内の微生物−微生物動態の観察を可能にする15,20。さらに、RNA FISH染色は、既知の種の感染およびコロニー形成を手動または自動化されたアプローチによって容易に定量化できる宿主-病原体相互作用研究に適用することができ、例えば、感染に対する耐性が増加または減少したC.エレガンス変異体を比較する際に、病原体負荷に関する洞察を提供することができる21。
野生のC.エレガンスは、さまざまな微生物と自然に関連しています。研究者はRNA FISHを使用して、これらの微生物を検出および識別し、動物全体の状況での微生物の局在についての洞察を得ることができます。望ましいまたは興味深い表現型を有する微生物は、この方法で同定し、次いでさらなる特性評価および配列決定のために単離することができる。野生のC.エレガンスからの多数の細菌分離株の存在量も、RNA FISH29を介して定量化できます。ここで説明するプロトコルを使用することにより、宿主内の既知の微生物を観察し、それらの相互作用についてさらに学ぶこともできます。重要なのは、オルセーウイルスと微胞子虫は絶対寄生虫であり、宿主から独立して培養することができないため、FISHが標準的な視覚化ツールです。コロニー形成または感染は、目的の所望の培養可能な細菌を播種したプレート上で増殖させた線虫を用いてRNA FISHによって定量化することもできる。C.エレガンス腸内の微生物を染色することに加えて、このプロトコルは、C.トロピカリスやOscheius tipulaeなどの他の線虫株にも使用できます19,23。
FISHプロトコルの主な利点は、C.エレガンスに関連する微生物を染色するためのシンプルで迅速かつ堅牢な方法を提供することです。FISH染色から生成される画像は、サンプル内のSSUの豊富なRNAを標的とするFISHプローブを利用することによって達成される高いS/N比を有する。通常、rDNAの30倍以上のレベルのrRNAが存在するため、rRNAを標的とするプローブによるFISH染色からのシグナルのほとんどは、rDNA30ではなくrRNAによるものです。さらに、RNA FISHは、動物全体の状況内で感染またはコロニー形成を見ることを可能にする。この視覚化は、宿主核をDAPIで共染色したり、蛍光マークを付けたC.エレガンス株を使用して、サンプル内の感染またはコロニー形成の局在をより強調したりすることで促進されます。例えば、異なる組織においてGFP発現を有するC.エレガンス株のパネルを用いて、線虫特異的FISHを用いて線虫ディスプロデレの組織向性を決定するために使用した20。さらに、このプロトコルは、研究者が特定のニーズに適した理想的な条件を決定することを可能にする変更(例えば、固定期間の調整、ハイブリダイゼーション温度の上昇)に適しています。
FISHプロトコルの重要なステップの1つは、サンプルの修正です。固定液の添加後のインキュベーション期間は、薬剤がサンプルを透過処理する時間を確保するために必要である。インキュベーション時間が長いと、トランスジェニック蛍光タンパク質を含むサンプルでは、PFAによるタンパク質の経時的な分解のため理想的ではありません。GFPを含むサンプルの場合、GFPシグナルを維持しながら、透過処理を可能にする最適な固定時間を決定することが不可欠です。
FISHは、C.エレガンスの細菌、ウイルス、または微胞子虫の染色に使用できます。ただし、FISHに使用される最適なタイプの固定剤は、サンプルと下流の要件によって異なります。このプロトコルは、細菌やウイルスを染色するための主要な固定剤としてPFA溶液を提示します。しかし、PFAは胞子壁を貫通できないため、小胞子胞子の可視化には不十分である。胞子の可視化には、代わりにアセトンを使用する必要があります。ただし、PFA固定は、スポロプラズム、メロン、スポロントなど、微胞子虫の他のライフステージのFISH標識に効率的です。アセトン固定とPFA固定の間には他の大きな違いが見られます。アセトンは、サンプルを追加した後、洗浄を必要とせずに冷凍庫にすばやく保存できるため、より便利です。しかし、アセトンはトランスジェニック宿主の既存のGFPを迅速に殺します。アセトン固定動物はより分解され、一部の組織の同定がより困難になるため、PFAは宿主のいくつかの生理学的構造を保存することが重要である場合に好ましい固定剤です。サンプルは固定されているため、このFISHプロトコルでは、in vivoでの宿主と微生物の相互作用のライブイメージングはできません。しかし、パルスチェイス感染の時間経過とそれに続く様々な時点でのサンプルのFISH染色は、微生物感染のいくつかのダイナミクスを見ることを可能にすることができる19、20、31。
プロトコル全体の別の重要なステップは、ハイブリダイゼーションの前後にサンプルを徹底的に洗浄することです。ハイブリダイゼーションの前に、ワームをマイクロフュージチューブに集めるとき、NGMプレートからの過剰なバクテリアまたは他の微生物をワームサンプルと共に運ぶことができる。PBS-Tによる3回の洗浄が標準です。ただし、特に高度に汚染された野生分離された C.エレガンスを使用する場合は、外部の微生物を十分に排除するために、より多くの洗浄が必要になる場合があります。FISHの後にマウントされたサンプルを表示する場合、サンプルのバックグラウンドで大量のシグナルを生成するFISHプローブが残っている可能性があります。洗浄温度と洗浄回数は、過剰で非特異的に結合したプローブを除去するために重要です。バックグラウンド蛍光を低減するために、1mLのWBで1時間1回の洗浄を行う代わりに、30分ごとに1mLのWBで2〜3回の洗浄を行うことが可能である。FISHプローブが異なれば、必要な洗浄温度も異なる場合があります。通常、洗浄温度はハイブリダイゼーション温度より2°C高いが、バックグラウンド蛍光が多すぎる(高ノイズ)場合は、これを増やすことができる。
FISHプロトコルは、種特異的微生物RNAを標的とするように設計された蛍光プローブを利用しますが、FISHプローブは他の高コピー転写物用に設計することができます。他のFISHプローブは融解温度が異なる場合があるため、インキュベーションステップは、説明されているよりも高い温度または低い温度で実行する必要があるかもしれません。FISH染色は、宿主内の微生物のコロニー形成または感染の空間分布を識別し、宿主-微生物および微生物-微生物相互作用の特性評価を可能にします。1つの制限は、同時に使用できる従来の蛍光色素がごくわずかであるため、FISHを介して同時に検出できる異なる微生物の数が減ることです。これは、C.エレガンスの複雑な微生物叢研究での使用を制限します。しかし、マルチカラーrRNAを標的とするFISHは、非標準的な蛍光色素で標識されたプローブを利用しているため、異なる微生物群標識の数を増やすことができます15。別の制限は、非常に類似したSSU配列を有する密接に関連した種、特に細菌を区別することが困難であることである。しかし、微胞子虫種間の極端な配列の相違は、このプロトコルによるそれらの分化を促進するのに役立ちます(図3)32,33。
全体として、このFISHプロトコルは、 C.エレガンス内の微生物を検出する技術について説明しています。これにより、研究者は透明で遺伝的に扱いやすいモデルシステムを使用して、無傷の動物のコンテキスト内でのコロニー形成と感染を検出および定量化し、宿主内の固有の微生物の行動または形態を特定できます。この原稿のプレプリント版は、レビュー34中に投稿されました。
The authors have nothing to disclose.
野生線虫株を提供してくれたマリー・アン・フェリックス博士に感謝します。この研究は、キャリアグラント2143718の下でNSFによって、RJLにCSUPER新研究者賞の下でカリフォルニア州立大学によって、ERTにR01 AG052622およびR01 GM114139の下でNIH、およびVLにアメリカ心臓協会フェローシップによってサポートされました。
10% SDS | Invitrogen | AM9822 | |
Acetone | Fisher Scientific | A-11-1 | |
Antifade mounting serum with DAPI (Vectashield) | Vectalab | NC9524612 | |
EDTA | Fisher Scientific | S311-500 | |
FISH probes (see Table 1) | LGC Biosearch Technologies | FISH probes were commercially purchased via custom oligonucleotide synthesis | |
KCl | Fisher Scientific | P217 | |
KH2PO4 | Fisher Scientific | P-286 | |
Na2HPO4 | Fisher Scientific | S375-500 | |
NaCl | Fisher Scientific | S-671 | |
NH4Cl | Fisher Scientific | A-661 | |
Paraformaldehyde | Electron Microscopy Science | 50-980-487 | CAUTION: PFA is a carcinogen. Handle appropriately |
Thermal mixer | Eppendorf | 5384000020 | |
Tris base | Fisher Scientific | BP152 | |
Triton X-100 | Fisher Scientific | BP-151 | |
Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 |