Les microbes intestinaux, y compris les bactéries extracellulaires et les agents pathogènes intracellulaires comme le virus d’Orsay et les microsporidies (champignons), sont souvent associés aux nématodes sauvages Caenorhabditis . Cet article présente un protocole pour détecter et quantifier les microbes qui colonisent et/ou infectent les nématodes C. elegans , et pour mesurer la charge pathogène après des infections contrôlées en laboratoire.
Les intestins des nématodes sauvages Caenorhabditis sont habités par une variété de micro-organismes, y compris les bactéries du microbiome intestinal et les agents pathogènes, tels que les microsporidies et les virus. En raison des similitudes entre Caenorhabditis elegans et les cellules intestinales de mammifères, ainsi que de la puissance du système C. elegans , cet hôte est devenu un système modèle pour étudier les interactions intestin-microbe hôte in vivo. Bien qu’il soit possible d’observer certains aspects de ces interactions avec la microscopie à fond clair, il est difficile de classer avec précision les microbes et de caractériser l’étendue de la colonisation ou de l’infection sans outils plus précis. L’hybridation in situ par fluorescence d’ARN (FISH) peut être utilisée comme outil pour identifier et visualiser les microbes chez les nématodes sauvages ou pour caractériser et quantifier expérimentalement l’infection chez les nématodes infectés par des microbes en laboratoire. Les sondes FISH, marquant l’ARN ribosomique de la petite sous-unité très abondante, produisent un signal lumineux pour les bactéries et les cellules microsporidiennes. Les sondes conçues pour cibler les régions conservées d’ARN ribosomique commun à de nombreuses espèces peuvent détecter un large éventail de microbes, tandis que cibler des régions divergentes de l’ARN ribosomique est utile pour une détection plus étroite. De même, les sondes peuvent être conçues pour marquer l’ARN viral. Un protocole de coloration de l’ARN FISH avec fixation de paraformaldéhyde (PFA) ou d’acétone est présenté. La fixation de PFA est idéale pour les nématodes associés aux bactéries, aux microsporidies et aux virus, tandis que la fixation de l’acétone est nécessaire pour la visualisation des spores de microsporida. Les animaux ont d’abord été lavés et fixés dans du paraformaldéhyde ou de l’acétone. Après fixation, les sondes FISH ont été incubées avec des échantillons pour permettre l’hybridation des sondes à la cible souhaitée. Les animaux ont de nouveau été lavés puis examinés sur des lames de microscope ou à l’aide d’approches automatisées. Dans l’ensemble, ce protocole FISH permet la détection, l’identification et la quantification des microbes qui habitent l’intestin de C. elegans , y compris les microbes pour lesquels il n’existe aucun outil génétique.
Caenorhabditis elegans est apparu comme un puissant système modèle pour étudier l’immunité innée et les interactions hôte-microbe dans les cellules épithéliales intestinales 1,2. En raison d’un corps transparent et de seulement 20 cellules intestinales, C. elegans représente un système pratique pour surveiller les processus de colonisation et d’infection intestinale microbienne dans le contexte d’un organisme intact. Les cellules intestinales des nématodes partagent de multiples similitudes morphologiques et fonctionnelles avec les cellules épithéliales intestinales des mammifères, ce qui en fait un modèle in vivo traitable pour la dissection des processus qui régissent la colonisation du microbiome et l’infection pathogène 3,4,5,6.
Les C. elegans sauvages se nourrissent d’une variété de microbes qui colonisent et infectent l’intestin, et l’échantillonnage de ces nématodes a permis de découvrir des virus, des eucaryotes (champignons, oomycètes) et des bactéries qui s’associent naturellement à cet hôte 7,8,9,10. Le virus d’Orsay a été trouvé infectant l’intestin et est actuellement le seul virus naturel connu de C. elegans9. Les microsporidies sont des agents pathogènes intracellulaires obligatoires liés aux champignons qui sont l’infection la plus fréquente chez les Caenorhabditis, plusieurs espèces ayant été découvertes infectant C. elegans et les nématodes apparentés 8,11. De nombreuses bactéries habitent couramment la lumière intestinale de C. elegans capturé dans la nature et plusieurs espèces ont été établies comme modèle naturel pour le microbiome de C. elegans (CeMbio)6,12,13,14. La découverte et la caractérisation des microbes qui colonisent et/ou infectent naturellement C. elegans sont essentielles pour comprendre les mécanismes génétiques qui régissent ces interactions hôte-microbe, ainsi que pour visualiser de nouveaux processus microbiens qui ne se produisent que dans le contexte d’un animal hôte intact.
Après l’échantillonnage, les nématodes sauvages sont examinés par microscopie à contraste interférentiel différentiel (CIVD) pour rechercher des phénotypes indiquant une infection ou une colonisation. Par exemple, des modifications de l’aspect granulé stéréotypé des cellules intestinales peuvent être associées à la présence d’une infection parasitaire intracellulaire8. Plus précisément, la perte des granules intestinaux et la diminution de la viscosité cytosolique sont des signes d’infection virale, tandis que la réorganisation des granules intestinaux en « rainures » peut indiquer une infection par des microsporidies dans le genre Nematocida 8,9. Étant donné qu’il existe une grande variété de microbes présents dans les échantillons sauvages de C. elegans, il peut être difficile de distinguer les microbes par microscopie DIC. L’information concernant la distribution spatiale des microbes au sein de l’hôte peut également être difficile à détecter en raison de la petite taille de nombreux microbes15. De plus, la culture in vitro de microbes particuliers d’intérêt n’est pas toujours possible, ce qui entraîne des difficultés de détection et/ou de quantification.
L’hybridation in situ par fluorescence d’ARN (FISH) fournit une méthode pour marquer des microbes par fluorescence en utilisant des sondes fluorescentes qui se lient à l’ARN de la petite sous-unité ribosomique (SSU) dans les cellules fixes. Si l’analyse des caractéristiques morphologiques suggère une classe particulière de microbes, des sondes FISH qui ciblent des classes spécifiques ou larges de ces microbes peuvent être utilisées. Par exemple, EUB338 est considéré comme une sonde universelle pour la SSU bactérienne et est couramment utilisée pour détecter un large éventail de bactéries16. Le protocole décrit ici utilise des sondes d’ADN simple brin qui sont marquées à l’extrémité avec un fluorophore et spécifiquement conçues pour être complémentaires à la SSU cible du microbe d’intérêt, bien qu’il existe des sondes précédemment conçues disponibles16. Le principal avantage du ciblage de la SSU des microbes est l’abondance relativement importante de cet ARN, qui comprend généralement 80% à 90% de tout l’ARN dans la cellule, conduisant à une coloration avec un rapport signal sur bruit très élevé17. Les sondes peuvent également être conçues pour cibler l’ARN afin de détecter les virus, comme le virus d’Orsay 9,18, qui sont souvent présents en très gros exemplaires dans les cellules infectées si le virus se réplique activement.
Selon les résultats obtenus avec des sondes connues, il peut être nécessaire d’obtenir d’autres informations de séquence pour concevoir des sondes plus spécifiques pour la confirmation des espèces in situ. Une approche courante consiste à utiliser des amorces universelles contre les régions conservées de l’USS (16S pour les bactéries et 18S pour les eucaryotes) pour amplifier (via PCR) les régions plus divergentes8. En utilisant ces informations de séquence, des sondes avec plus de spécificité d’espèce peuvent être conçues. Ces sondes FISH peuvent ensuite permettre l’identification des microbes de manière indépendante de la culture8. De plus, ARN FISH peut donner un aperçu des caractéristiques morphologiques uniques de colonisation et d’infection, y compris les modèles de filamentation ou de localisation tissulaire19,20. Des sondes FISH de différentes couleurs peuvent être utilisées simultanément, ce qui permet une distinction visuelle entre les microbes dans des échantillons de nématodes sauvages, ainsi que l’observation de la dynamique microbe-microbe à l’intérieur d’un hôte15,20. En outre, la coloration ARN FISH peut être appliquée aux études d’interaction hôte-pathogène où l’infection et la colonisation d’une espèce connue peuvent être facilement quantifiées manuellement ou par des approches automatisées pour fournir des informations sur la charge pathogène, par exemple, en comparant les mutants de C. elegans qui ont augmenté ou diminué la résistance à l’infection21.
Wild C. elegans est naturellement associé à une variété de microbes. Les chercheurs peuvent utiliser ARN FISH pour détecter et identifier ces microbes ainsi que pour mieux comprendre leur localisation dans le contexte d’un animal entier. Les microbes ayant des phénotypes souhaitables ou intéressants peuvent être identifiés grâce à cette méthode, puis isolés pour une caractérisation et un séquençage plus approfondis. L’abondance de nombreux isolats bactériens de C. elegans sauvage peut également être quantifiée par ARN FISH29. En utilisant le protocole décrit ici, il est également possible d’observer des micro-organismes connus à l’intérieur de leurs hôtes et d’en apprendre davantage sur leurs interactions. Il est important de noter que le virus d’Orsay et les microsporidies sont des parasites obligatoires et ne peuvent pas être cultivés indépendamment de l’hôte, de sorte que FISH est l’outil de visualisation standard. La colonisation ou l’infection peut également être quantifiée par ARN FISH en utilisant des nématodes cultivés sur des plaques ensemencées avec une bactérie cultivable d’intérêt désirée. En plus de colorer les micro-organismes dans l’intestin de C. elegans, ce protocole peut être utilisé pour d’autres souches de nématodes comme C. tropicalis ou Oscheius tipulae 19,23.
Le principal avantage du protocole FISH est qu’il offre une méthode simple, rapide et robuste pour colorer les microbes associés à C. elegans. Les images produites à partir de la coloration FISH ont un rapport signal sur bruit élevé, obtenu en utilisant des sondes FISH qui ciblent l’ARN abondant du SSU dans l’échantillon. Parce qu’il y a généralement des niveaux 30x ou plus d’ARNr que d’ADNr, la plupart du signal de la coloration FISH avec des sondes qui ciblent l’ARNr est dû à l’ARNr plutôt qu’à l’ADNr30. De plus, ARN FISH permet de voir l’infection ou la colonisation dans le contexte de l’animal entier. Cette visualisation est facilitée par la co-coloration des noyaux hôtes avec le DAPI et/ou l’utilisation de souches fluorescentes de C. elegans pour mieux mettre en évidence la localisation de l’infection ou de la colonisation dans l’échantillon. Par exemple, le FISH spécifique au microsporidien a été utilisé pour déterminer le tropisme tissulaire de Nematocida displodere en utilisant un panel de souches de C. elegans avec expression GFP dans différents tissus20. De plus, ce protocole se prête à des changements qui permettent aux chercheurs de déterminer les conditions idéales adaptées à leurs besoins spécifiques (p. ex., ajustement de la période de fixation, augmentation de la température d’hybridation).
Une étape critique du protocole FISH consiste à fixer les échantillons. La période d’incubation suivant l’ajout du fixateur est nécessaire pour laisser le temps à l’agent de perméabiliser l’échantillon. Des temps d’incubation plus longs ne sont pas idéaux pour les échantillons contenant des protéines fluorescentes transgéniques en raison de la dégradation des protéines par le PFA au fil du temps. Pour les échantillons contenant de la GFP, il est impératif de déterminer le temps de fixation optimal pour permettre la perméabilisation, tout en maintenant le signal GFP.
FISH peut être utilisé pour colorer les bactéries, les virus ou les microsporidies chez C. elegans. Cependant, le meilleur type d’agent fixateur utilisé pour FISH dépend de l’échantillon et des exigences en aval. Ce protocole présente une solution de PFA comme principal agent fixateur pour colorer les bactéries et les virus. Cependant, le PFA n’est pas suffisant pour la visualisation des spores microsporidiennes car il ne peut pas pénétrer la paroi des spores. Pour la visualisation des spores, l’acétone doit être utilisée à la place. Cependant, la fixation du PFA est efficace pour le marquage FISH d’autres stades de vie des microsporidies, y compris les sporoplasmes, les mérons et les sporontes. D’autres différences majeures sont observées entre la fixation de l’acétone et la fixation par PFA; L’acétone est plus pratique car les échantillons peuvent être rapidement conservés au congélateur après avoir été ajoutés, sans avoir besoin de les laver. Cependant, l’acétone tue rapidement toute GFP existante chez un hôte transgénique. Le PFA est le fixateur préféré s’il est important de préserver certaines structures physiologiques chez l’hôte, car les animaux fixés à l’acétone semblent être plus dégradés, ce qui rend l’identification de certains tissus plus difficile. Étant donné que les échantillons sont fixes, ce protocole FISH ne permet pas l’imagerie en direct des interactions hôte-microbe in vivo. Cependant, un cours temporel d’infection par la chasse au pouls suivi d’une coloration FISH des échantillons à divers moments peut permettre de voir une certaine dynamique de l’infection microbienne 19,20,31.
Une autre étape critique tout au long du protocole est le lavage complet des échantillons avant et après l’hybridation. Avant l’hybridation, lors de la collecte des vers dans les tubes de microfuge, les bactéries en excès ou d’autres microbes des plaques NGM peuvent être transportés avec l’échantillon de ver. Trois lavages avec PBS-T sont standard; cependant, d’autres lavages peuvent être nécessaires pour éliminer suffisamment les microorganismes externes, en particulier lors de l’utilisation de C. elegans isolé dans la nature fortement contaminé. Lors de l’observation des échantillons montés après FISH, il peut y avoir une sonde FISH résiduelle qui produit de grandes quantités de signal en arrière-plan de l’échantillon. La température de lavage et le nombre de lavages sont importants pour éliminer l’excès et la sonde non spécifiquement liée. Pour réduire la fluorescence de fond, il est possible d’effectuer deux ou trois lavages avec 1 mL de WB toutes les 30 min, au lieu d’un lavage avec 1 mL de WB pendant une heure. Différentes sondes FISH peuvent nécessiter des températures de lavage différentes. En règle générale, la température de lavage est supérieure de 2 °C à la température d’hybridation, mais elle peut être augmentée s’il y a trop de fluorescence de fond (bruit élevé).
Le protocole FISH utilise des sondes fluorescentes conçues pour cibler l’ARN microbien spécifique à l’espèce, mais les sondes FISH peuvent être conçues pour d’autres transcrits à copie élevée. D’autres sondes FISH peuvent avoir des températures de fusion différentes, de sorte que les étapes d’incubation peuvent devoir être effectuées à une température plus élevée ou plus basse que celle décrite. La coloration FISH peut identifier la distribution spatiale de la colonisation microbienne ou de l’infection au sein de l’hôte, ce qui permet de caractériser les interactions hôte-microbe et microbe-microbe. L’une des limites est que seuls quelques fluorophores conventionnels peuvent être utilisés simultanément, ce qui réduit le nombre de micro-organismes différents pouvant être détectés via FISH en même temps. Cela limite son utilisation pour les études complexes du microbiome chez C. elegans. Cependant, FISH multicolore ciblant l’ARNr utilise des sondes marquées avec des fluorophores non canoniques qui peuvent augmenter le nombre de marqueurs de groupes microbiens distincts15. Une autre limite est qu’il est difficile de distinguer les espèces étroitement apparentées, en particulier les bactéries, qui ont des séquences SSU très similaires. Cependant, la divergence extrême des séquences entre les espèces de microsporidies contribue à faciliter leur différenciation avec ce protocole (Figure 3)32,33.
Dans l’ensemble, ce protocole FISH décrit une technique de détection des micro-organismes chez C. elegans. Il permet aux chercheurs d’utiliser un système modèle transparent et génétiquement traitable pour détecter et quantifier la colonisation et l’infection dans le contexte d’un animal intact, ainsi que pour identifier le comportement microbien ou la morphologie unique de l’hôte. Une version préimprimée de ce manuscrit a été publiée lors de la revue34.
The authors have nothing to disclose.
Merci à la Dre Marie-Anne Félix de nous avoir fourni des souches de nématodes sauvages. Ce travail a été soutenu par la NSF dans le cadre de la subvention CAREER 2143718 et la California State University dans le cadre d’une bourse CSUPERB New Investigator à RJL, NIH sous R01 AG052622 et R01 GM114139 à ERT, et par une bourse de l’American Heart Association à VL.
10% SDS | Invitrogen | AM9822 | |
Acetone | Fisher Scientific | A-11-1 | |
Antifade mounting serum with DAPI (Vectashield) | Vectalab | NC9524612 | |
EDTA | Fisher Scientific | S311-500 | |
FISH probes (see Table 1) | LGC Biosearch Technologies | FISH probes were commercially purchased via custom oligonucleotide synthesis | |
KCl | Fisher Scientific | P217 | |
KH2PO4 | Fisher Scientific | P-286 | |
Na2HPO4 | Fisher Scientific | S375-500 | |
NaCl | Fisher Scientific | S-671 | |
NH4Cl | Fisher Scientific | A-661 | |
Paraformaldehyde | Electron Microscopy Science | 50-980-487 | CAUTION: PFA is a carcinogen. Handle appropriately |
Thermal mixer | Eppendorf | 5384000020 | |
Tris base | Fisher Scientific | BP152 | |
Triton X-100 | Fisher Scientific | BP-151 | |
Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 |