חיידקי מעיים, כולל חיידקים חוץ-תאיים ופתוגנים תוך-תאיים כמו נגיף אורסיי ומיקרוספורידיה (פטריות), קשורים לעתים קרובות לנמטודות פראיות של Caenorhabditis . מאמר זה מציג פרוטוקול לאיתור וכימות מיקרובים המאכלסים ו/או מדביקים נמטודות C. elegans , ולמדידת עומס פתוגנים לאחר זיהומים מבוקרים במעבדה.
המעיים של נמטודות Caenorhabditis פראיות מאוכלסים על ידי מגוון מיקרואורגניזמים, כולל חיידקי מיקרוביום המעי ופתוגנים, כגון מיקרוספורידיה ווירוסים. בגלל הדמיון בין Caenorhabditis elegans לבין תאי מעיים של יונקים, כמו גם העוצמה של מערכת C. elegans , פונדקאי זה התפתח כמערכת מודל לחקר אינטראקציות בין המעי למיקרוב המארח in vivo. בעוד שניתן לצפות בהיבטים מסוימים של אינטראקציות אלה עם מיקרוסקופיה של שדה בהיר, קשה לסווג במדויק מיקרובים ולאפיין את מידת הקולוניזציה או הזיהום ללא כלים מדויקים יותר. הכלאה פלואורסצנטית של רנ”א באתרה (FISH) יכולה לשמש ככלי לזיהוי והדמיה של מיקרובים בנמטודות מהטבע או לאפיון וכימות ניסיוני של זיהום בנמטודות הנגועות במיקרובים במעבדה. בדיקות FISH, המתייגות את הרנ”א הריבוזומלי הקטן הנפוץ ביותר, מייצרות אות בהיר לחיידקים ולתאים מיקרוספורידיים. גשושיות שנועדו להתמקד באזורים שמורים של רנ”א ריבוזומלי המשותף למינים רבים יכולות לזהות מגוון רחב של מיקרובים, בעוד שהתמקדות באזורים מתפצלים של הרנ”א הריבוזומלי שימושית לגילוי צר יותר. באופן דומה, ניתן לתכנן בדיקות כדי לסמן RNA נגיפי. פרוטוקול לצביעת RNA FISH עם פרפורמלדהיד (PFA) או קיבוע אצטון מוצג. קיבוע PFA אידיאלי לנמטודות הקשורות לחיידקים, מיקרוספורידיה ווירוסים, בעוד שקיבוע אצטון נחוץ להדמיה של נבגי מיקרוספורידה. בעלי חיים נשטפו תחילה ותוקנו בפרפורמלדהיד או אצטון. לאחר הקיבוע, גשושיות FISH הודגמו עם דגימות כדי לאפשר הכלאה של גשושיות למטרה הרצויה. בעלי החיים נשטפו שוב ואז נבדקו בשקופיות מיקרוסקופ או בגישות אוטומטיות. באופן כללי, פרוטוקול FISH זה מאפשר זיהוי, זיהוי וכימות של המיקרובים המאכלסים את המעי C. elegans , כולל מיקרובים שעבורם אין כלים גנטיים זמינים.
Caenorhabditis elegans התגלתה כמערכת מודל רבת עוצמה לחקר חסינות מולדת ואינטראקציות בין חיידקים מארחים בתאי אפיתל המעי 1,2. בשל היותו בעל גוף שקוף ורק 20 תאי מעיים, C. elegans מייצג מערכת נוחה לניטור תהליכים של התיישבות מעיים מיקרוביאלית וזיהום בהקשר של אורגניזם שלם. תאי המעי של נמטודה חולקים קווי דמיון מורפולוגיים ותפקודיים מרובים עם תאי אפיתל במעיים של יונקים, מה שהופך אותם למודל in vivo הניתן להעברה של תהליכים השולטים בהתיישבות במיקרוביום ובזיהום פתוגנים 3,4,5,6.
חיידקי הבר ניזונים ממגוון מיקרובים המאכלסים ומדביקים את המעי, ודגימה של נמטודות אלה הביאה לגילוי נגיפים, אאוקריוטים (פטריות, אומיצטים) וחיידקים המתקשרים באופן טבעי למארח זה 7,8,9,10. נגיף האורסיי נמצא מדביק את המעי וכיום הוא הנגיף הטבעי היחיד הידוע של C. elegans9. מיקרוספורידיה הם פתוגנים תוך-תאיים הקשורים לפטריות שהם הזיהום הנפוץ ביותר ב-Caenorhabditis שנלכדו בטבע, כאשר מספר מינים התגלו כשהם מדביקים C. elegans ונמטודות קשורות 8,11. חיידקים רבים נמצאים בדרך כלל מאכלסים את לומן המעיים של C. elegans שנלכדו בטבע, וכמה מינים הוקמו כמודל טבעי למיקרוביום C. elegans (CeMbio)6,12,13,14. גילוי ואפיון מיקרובים המתיישבים באופן טבעי ו/או מדביקים את C. elegans חיוניים להבנת המנגנונים הגנטיים השולטים באינטראקציות אלה בין הפונדקאי למיקרוב, כמו גם להמחשת תהליכים מיקרוביאליים חדשים המתרחשים רק בהקשר של חיה מארחת שלמה.
לאחר הדגימה, נמטודות בר נבדקות באמצעות מיקרוסקופיה של ניגודיות הפרעה דיפרנציאלית (DIC) כדי לחפש פנוטיפים המעידים על זיהום או התיישבות. לדוגמה, שינויים במראה המגורען הסטריאוטיפי של תאי המעי יכולים להיות קשורים לנוכחות של זיהום טפיל תוך תאי8. באופן ספציפי, אובדן גרגירי המעיים וירידה בצמיגות הציטוזולית הם סימנים לזיהום ויראלי, בעוד שארגון מחדש של גרגירי המעיים ל’חריצים’ עשוי להצביע על זיהום במיקרוספורידיה בסוג Nematocida 8,9. מאחר שיש מגוון רחב של מיקרובים שנמצאים בדגימות של C. elegans פראיים, קשה להבחין בין מיקרובים באמצעות מיקרוסקופ DIC. מידע על ההתפלגות המרחבית של מיקרובים בתוך המארח עשוי גם להיות קשה לזיהוי בשל גודלם הקטן של מיקרוביםרבים 15. בנוסף, לא תמיד ניתן לגדל מיקרובים מסוימים בעלי עניין במבחנה, מה שמוביל לקשיים באיתור ו/או כימות.
הכלאה פלואורסצנטית של רנ”א באתרה (FISH) מספקת שיטה לתיוג פלואורסצנטי של מיקרובים על ידי שימוש בגשושיות פלואורסצנטיות הנקשרות לרנ”א של תת-היחידה הריבוזומלית הקטנה (SSU) בתאים קבועים. אם ניתוח של מאפיינים מורפולוגיים מציע סוג מסוים של מיקרובים, ניתן להשתמש בבדיקות FISH המכוונות למחלקות ספציפיות או רחבות של מיקרובים כאלה. לדוגמה, EUB338 נחשב לבדיקה אוניברסלית עבור החיידק SSU והוא משמש בדרך כלל לאיתור מגוון רחב של חיידקים16. הפרוטוקול המתואר כאן משתמש בגשושיות דנ”א חד-גדיליות המסומנות סופית בפלואורופור ותוכננו במיוחד כדי להיות משלימות את המטרה SSU של המיקרוב המעניין, אם כי ישנן בדיקות שתוכננו בעברזמינות 16. היתרון העיקרי של התמקדות ב-SSU של מיקרובים הוא השפע הגדול יחסית של רנ”א זה, המהווה בדרך כלל 80%-90% מכלל הרנ”א בתא, מה שמוביל להכתמה עם יחס אות לרעש גבוה מאוד17. ניתן גם לתכנן גשושיות שיתמקדו ב-RNA כדי לזהות נגיפים, כמו נגיףה-Orsay 9,18, שלעתים קרובות נמצאים בעותקים גבוהים מאוד בתאים נגועים אם הנגיף משתכפל באופן פעיל.
בהתאם לתוצאות עם בדיקות ידועות, ייתכן שיהיה צורך לקבל מידע רצף נוסף כדי לתכנן בדיקות ספציפיות יותר לאישור מינים באתרם. גישה נפוצה היא להשתמש בפריימרים אוניברסליים נגד אזורים שמורים של ה-SSU (16S לחיידקים ו-18S לאאוקריוטים) כדי להגביר (באמצעות PCR) אזורים שהםיותר שונים מ-8. באמצעות מידע רצף זה, ניתן לתכנן בדיקות עם ספציפיות רבה יותר למינים. לאחר מכן, בדיקות FISH אלה יכולות לאפשר זיהוי של מיקרובים באופן שאינו תלוי בתרבית8. בנוסף, RNA FISH יכול לתת תובנה לגבי מאפיינים ייחודיים של התיישבות מורפולוגית וזיהום, כולל נימה או דפוסי לוקליזציה של רקמות19,20. ניתן להשתמש בו-זמנית בגשושיות FISH בצבעים שונים, מה שמאפשר הבחנה חזותית בין מיקרובים בדגימות נמטודות בר, כמו גם תצפית על דינמיקה של מיקרובים-מיקרובים בתוךפונדקאי 15,20. יתר על כן, צביעת RNA FISH יכולה להיות מיושמת במחקרי אינטראקציה בין פונדקאי לפתוגן שבהם ניתן לכמת בקלות זיהום והתיישבות של מין ידוע באופן ידני או באמצעות גישות אוטומטיות כדי לספק תובנות על עומס פתוגנים, למשל, בהשוואה בין מוטציות C. elegans שיש להן עמידות מוגברת או מופחתת לזיהום21.
C. elegans פראיים קשורים באופן טבעי למגוון מיקרובים. חוקרים יכולים להשתמש ב-RNA FISH כדי לזהות ולזהות את המיקרובים האלה, כמו גם לקבל תובנה לגבי לוקליזציה שלהם בהקשר של חיה שלמה. ניתן לזהות מיקרובים עם פנוטיפים רצויים או מעניינים באמצעות שיטה זו ולאחר מכן לבודד אותם לאפיון וריצוף נוספים. ניתן לכמת את השפע של חיידקים רבים המבודדים מ-C. elegans פראיים גם באמצעות RNA FISH29. על ידי שימוש בפרוטוקול המתואר כאן, ניתן גם לצפות במיקרואורגניזמים ידועים בתוך המארחים שלהם וללמוד יותר על האינטראקציות שלהם. חשוב לציין כי נגיף אורסיי ומיקרוספורידיה הם טפילים מחייבים ולא ניתן לתרבת אותם באופן עצמאי מהפונדקאי, ולכן FISH הוא כלי ההדמיה הסטנדרטי. ניתן לכמת קולוניזציה או זיהום גם באמצעות RNA FISH באמצעות נמטודות הגדלות על צלחות שנזרעו עם חיידק רצוי בעל עניין. בנוסף להכתמת מיקרואורגניזמים במעי C. elegans, פרוטוקול זה יכול לשמש עבור זני נמטודות אחרים כמו C. tropicalis או Oscheius tipulae 19,23.
היתרון העיקרי של פרוטוקול FISH הוא שהוא מציע שיטה פשוטה, מהירה וחזקה להכתים חיידקים הקשורים ל- C. elegans. לתמונות המיוצרות מכתמי FISH יש יחס אות לרעש גבוה, אשר מושג על ידי שימוש בגשושיות FISH המכוונות ל-RNA השופע של ה-SSU בתוך הדגימה. מאחר שבדרך כלל יש רמות גבוהות פי 30 או יותר של rRNA מאשר rDNA, רוב האות מ-FISH שמכתים בגששים שמכוונים ל-rRNA נובע מ-rRNA ולא מ-rDNA30. יתר על כן, RNA FISH מאפשר לראות זיהום או קולוניזציה בהקשר של החיה כולה. הדמיה זו מתאפשרת באמצעות צביעה משותפת של גרעיני מארח עם DAPI ו/או שימוש בזני C. elegans המסומנים בפלואורסצנט כדי להדגיש טוב יותר את לוקליזציה של זיהום או קולוניזציה בתוך הדגימה. לדוגמה, נעשה שימוש ב-FISH ספציפי למיקרוספורידיאן כדי לקבוע את טרופיזם הרקמות של Nematocida displodere על ידי שימוש בפאנל של זני C. elegans עם ביטוי GFP ברקמות שונות20. בנוסף, פרוטוקול זה מקובל על שינויים המאפשרים לחוקרים לקבוע את התנאים האידיאליים המתאימים לצרכים הספציפיים שלהם (למשל, התאמת תקופת הקיבוע, העלאת טמפרטורת ההכלאה).
שלב קריטי אחד בפרוטוקול FISH הוא תיקון הדגימות. תקופת הדגירה לאחר הוספת הקיבעון נחוצה כדי לאפשר זמן לסוכן לחלחל לדגימה. זמני דגירה ארוכים יותר אינם אידיאליים לדגימות המכילות חלבונים פלואורסצנטיים מהונדסים עקב פירוק חלבונים על ידי PFA לאורך זמן. עבור דגימות המכילות GFP, חובה לקבוע את זמן הקיבוע האופטימלי כדי לאפשר חדירה, תוך שמירה על אות ה- GFP.
ניתן להשתמש ב-FISH כדי להכתים חיידקים, וירוסים או מיקרוספורידיה ב-C. elegans. עם זאת, הסוג הטוב ביותר של סוכן מקבע המשמש עבור FISH תלוי בדרישות המדגם במורד הזרם. פרוטוקול זה מציג פתרון PFA כחומר המקבע העיקרי להכתמת חיידקים ווירוסים. עם זאת, PFA אינו מספיק להדמיה של נבגים מיקרוספורידיים מכיוון שהוא אינו יכול לחדור את דופן הנבג. עבור הדמיה של נבגים, אצטון צריך לשמש במקום. אמנם, קיבוע PFA יעיל לתיוג FISH של שלבי חיים אחרים של מיקרוספורידיה, כולל ספורופלסמות, מרונטים וספורונטים. הבדלים משמעותיים אחרים נראים בין קיבוע אצטון לקיבוע PFA; אצטון נוח יותר מכיוון שניתן לאחסן דגימות במהירות במקפיא לאחר ההוספה, ללא צורך בכביסה. עם זאת, אצטון הורג במהירות כל GFP קיים בפונדקאי מהונדס. PFA הוא המקבע המועדף אם חשוב לשמר כמה מבנים פיזיולוגיים בפונדקאי, שכן בעלי חיים קבועים באצטון נראים מושפלים יותר, מה שמקשה על זיהוי של רקמות מסוימות. מאחר שהדגימות קבועות, פרוטוקול FISH זה אינו מאפשר הדמיה חיה של אינטראקציות בין חיידקים מארחים ב-vivo. עם זאת, מסלול זמן של זיהום מרדף דופק ואחריו הכתמת FISH של דגימות בנקודות זמן שונות יכול לאפשר לראות דינמיקה מסוימת של זיהום מיקרוביאלי 19,20,31.
שלב קריטי נוסף לאורך הפרוטוקול הוא שטיפה יסודית של הדגימות לפני ואחרי הכלאה. לפני הכלאה, בעת איסוף התולעים לתוך צינורות microfuge, חיידקים עודפים, או מיקרובים אחרים מלוחות NGM ניתן לשאת עם דגימת התולעת. שלוש כביסות עם PBS-T הן סטנדרטיות; עם זאת, יותר שטיפות עשוי להיות נחוץ כדי לחסל מספיק מיקרואורגניזמים חיצוניים, במיוחד בעת שימוש מזוהם בכבדות, בר מבודד C. elegans. בעת צפייה בדגימות המותקנות לאחר FISH, ייתכן שיש גשושית FISH שיוצרת כמויות גדולות של אות ברקע הדגימה. טמפרטורת הכביסה ומספר הכביסות חשובים כדי להסיר את הבדיקה העודפת והלא ספציפית הקשורה. כדי להפחית את פלואורסצנטיות הרקע, ניתן לבצע שתיים או שלוש שטיפות עם 1 מ”ל של WB כל 30 דקות, במקום שטיפה אחת עם 1 מ”ל של WB במשך שעה. בדיקות FISH שונות עשויות לדרוש טמפרטורות שטיפה שונות. בדרך כלל, טמפרטורת הכביסה היא 2 מעלות צלזיוס מעל טמפרטורת ההכלאה, אך ניתן להגדיל זאת אם יש יותר מדי פלואורסצנטיות רקע (רעש גבוה).
פרוטוקול FISH משתמש בגשושיות פלואורסצנטיות שנועדו להתמקד ב-RNA מיקרוביאלי ספציפי למינים, אך ניתן לתכנן גשושיות FISH עבור תעתיקים אחרים בעלי עותק גבוה. לבדיקות FISH אחרות עשויות להיות טמפרטורות התכה שונות, ולכן ייתכן שיהיה צורך לבצע שלבי דגירה בטמפרטורה גבוהה או נמוכה יותר מהמתואר. צביעת FISH יכולה לזהות את ההתפלגות המרחבית של התיישבות מיקרוביאלית או זיהום בתוך הפונדקאי, ומאפשרת אפיון של אינטראקציות בין מיקרוב מארח למיקרוב ולמיקרוב-מיקרוב. מגבלה אחת היא שניתן להשתמש בו זמנית רק בפלואורופורים קונבנציונליים מעטים, מה שמפחית את מספר המיקרואורגניזמים השונים שניתן לזהות באמצעות FISH בו זמנית. זה מגביל את השימוש בו למחקרי מיקרוביום מורכבים ב– C. elegans. עם זאת, FISH ממוקד rRNA צבעוני משתמש בגשושיות המסומנות בפלואורופורים לא קנוניים שיכולים להגדיל את מספר התוויות של קבוצות מיקרוביאליות שונות15. מגבלה נוספת היא שקשה להבחין בין מינים קרובים, במיוחד חיידקים, שיש להם רצפי SSU דומים מאוד. עם זאת, סטיית הרצף הקיצונית בין מיני מיקרוספורידיה עוזרת להקל על ההתמיינות שלהם באמצעות פרוטוקול זה (איור 3)32,33.
באופן כללי, פרוטוקול FISH זה מתאר טכניקה לזיהוי מיקרואורגניזמים בתוך C. elegans. היא מאפשרת לחוקרים להשתמש במערכת מודל שקופה וניתנת למתיחה גנטית כדי לזהות ולכמת התיישבות וזיהום בהקשר של חיה שלמה, כמו גם לזהות התנהגות מיקרוביאלית ייחודית או מורפולוגיה בתוך הפונדקאי. גרסה מודפסת מראש של כתב יד זה פורסמה במהלך סקירה34.
The authors have nothing to disclose.
תודה לד”ר מארי-אן פליקס על שסיפקה לנו זני נמטודות פראיים. עבודה זו נתמכה על ידי NSF תחת מענק קריירה 2143718 ואוניברסיטת קליפורניה סטייט תחת פרס חוקר חדש של CSUPERB ל- RJL, NIH תחת R01 AG052622 ו- R01 GM114139 ל- ERT, ועל ידי מלגת איגוד הלב האמריקאי ל- VL.
10% SDS | Invitrogen | AM9822 | |
Acetone | Fisher Scientific | A-11-1 | |
Antifade mounting serum with DAPI (Vectashield) | Vectalab | NC9524612 | |
EDTA | Fisher Scientific | S311-500 | |
FISH probes (see Table 1) | LGC Biosearch Technologies | FISH probes were commercially purchased via custom oligonucleotide synthesis | |
KCl | Fisher Scientific | P217 | |
KH2PO4 | Fisher Scientific | P-286 | |
Na2HPO4 | Fisher Scientific | S375-500 | |
NaCl | Fisher Scientific | S-671 | |
NH4Cl | Fisher Scientific | A-661 | |
Paraformaldehyde | Electron Microscopy Science | 50-980-487 | CAUTION: PFA is a carcinogen. Handle appropriately |
Thermal mixer | Eppendorf | 5384000020 | |
Tris base | Fisher Scientific | BP152 | |
Triton X-100 | Fisher Scientific | BP-151 | |
Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 |