La reactivación in vitro de las células móviles es un experimento crucial para comprender los mecanismos de la motilidad celular. El protocolo describe la reactivación de los modelos de células desmembranadas de Chlamydomonas reinhardtii, un organismo modelo para estudiar los cilios/flagelos.
Desde el experimento histórico sobre la contracción del músculo glicerinado mediante la adición de ATP, que Szent-Györgyi demostró a mediados del siglo 20, la reactivación in vitro de las células desmembranadas ha sido una forma tradicional y potente de examinar la motilidad celular. La ventaja fundamental de este método experimental es que la composición de la solución de reactivación puede cambiarse fácilmente. Por ejemplo, un entorno de alta concentraciónde Ca 2+ que ocurre solo temporalmente debido a la excitación de la membrana in vivo se puede replicar en el laboratorio. Los cilios eucariotas (también conocidos como flagelos) son elaboradas máquinas de motilidad cuyos mecanismos reguladores aún no se han aclarado. El alga verde unicelular Chlamydomonas reinhardtii es un excelente organismo modelo en el campo de investigación de los cilios. Los experimentos de reactivación utilizando modelos celulares demembranados de C. reinhardtii y sus derivados, como los axonemas demembranados de cilios aislados, han contribuido significativamente a comprender los mecanismos moleculares de la motilidad ciliar. Esos experimentos aclararon que el ATP energiza la motilidad ciliar y que varias señales celulares, incluyendo Ca2+, cAMP y especies reactivas de oxígeno, modulan los movimientos ciliares. El método preciso para la demembranación de las células de C. reinhardtii y la reactivación de los modelos celulares se describe aquí.
La reactivación in vitro de células móviles desmembranadas es una herramienta valiosa para estudiar las bases moleculares del mecanismo regulador de la motilidad celular. Szent-Györgyi demostró por primera vez la contracción in vitro de las fibras musculares esqueléticas de conejo extraídas con 50% de glicerol mediante la adición de trifosfato de adenosina (ATP)1. Este experimento fue el primero en demostrar que el ATP energiza la contracción muscular. La metodología pronto se aplicó al estudio de la motilidad ciliar/flagelar energizada por ATP, como los flagelos 2 de los espermatozoides, los ciliosde Paramecium 3 y los cilios de Chlamydomonas reinhardtii (también llamados flagelos)4 utilizando detergentes no iónicos para la demembranación.
El alga verde unicelular C. reinhardtii es un organismo modelo para el estudio de los cilios: nada con dos cilios golpeándolos como la braza de un humano5. El movimiento ciliar es impulsado por la dineína, una proteína motora basada en microtúbulos dirigidos de extremo negativo 6,7. Las dineínas ciliares se pueden clasificar en dineínas del brazo externo y dineínas del brazo interno. Los mutantes que carecen de cada tipo de dineína se han aislado como mutantes de natación lenta con diferentes anomalías de motilidad. El análisis detallado de la motilidad in vitro de estos mutantes ha avanzado significativamente en la investigación de la dineína8.
Se han logrado muchos hallazgos importantes utilizando este método y sus derivados desde que se estableció el experimento de reactivación in vitro de células C. reinhardtii desmembranadas (modelos celulares). La reactivación de modelos celulares en una serie de tampones de Ca2+, por ejemplo, mostró9 que dos cilios están regulados de manera diferente por Ca2+ submicromolar, y este control asimétrico de los cilios permite la orientación fototáctica de C. reinhardtii10. Además, ambos cilios muestran la conversión de la forma de onda del modo de natación hacia adelante (llamado forma de onda asimétrica) al modo de natación hacia atrás (llamado forma de onda simétrica que aparece durante un corto período cuando las células están foto-o-mecano-chocadas)11,12. Esta conversión de forma de onda está regulada por Ca2+ submilimolar, que se demostró mediante la reactivación del llamado aparato nucleoflagelar (un complejo que contiene dos cilios, los cuerpos basales, las estructuras que unen los cuerpos basales con el núcleo y el remanente del núcleo)11 o axonemas demembranados de cilios aislados13. Aparte de Ca2+, el aplomo redox (reducción-oxidación) es una señal que regula la frecuencia de latido ciliar, que se demostró mediante la reactivación de modelos celulares en tampones redox que contienen diferentes proporciones de glutatión reducido vs. glutatión oxidado14. Además, el monofosfato de adenosina cíclico (cAMP) regula asimétricamente dos cilios, lo que se demostró mediante la reactivación de axonemas con cAMP15 enjaulado fotocleavable. Estos hallazgos in vitro, combinados con hallazgos genéticos, han llevado a una comprensión más profunda de los mecanismos moleculares de la regulación de los cilios en C. reinhardtii.
Aquí se describe un protocolo para reactivar los modelos celulares. El método es simple, permite varias modificaciones y se puede aplicar a múltiples organismos que se mueven con cilios. Sin embargo, debido a que las células desmembranadas son frágiles, se requieren algunos consejos para reactivar la motilidad de los modelos celulares con buena eficiencia al tiempo que se evita la deciliación.
Hay dos pasos críticos en este protocolo. El primero es un proceso conocido como demembranación, que debe llevarse a cabo de manera suave pero exhaustiva. La deciliación (es decir, la separación de los cilios del cuerpo celular) es inducida por pipeteos vigorosos o vórtices, lo que hace que los modelos celulares queden inmóviles incluso después de la adición de ATP. Típicamente, 5 × 107 células están suspendidas en ~0.5 mL de tampón de demembranación (densidad celular final: 1 × 108 c…
The authors have nothing to disclose.
Este estudio fue apoyado por subvenciones de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia KAKENHI (https://www.jsps.go.jp/english/index.html) a N.U. (19K23758, 21K06295) y K.W. (19H03242, 20K21420, 21H00420), de la Ohsumi Frontier Science Foundation (https://www.ofsf.or.jp/en/) a K.W., y de la Alianza Dinámica para la Innovación Abierta Uniendo Humanos, Medio Ambiente y Materiales (http://alliance.tagen.tohoku.ac.jp/english/) a N.U. y K.W. Agradecemos a la Sra. Miyuki Shinohara (Hosei Univ.) por su ayuda en la preparación de las cifras.
0.5 mL plastic tube | QSP | 502-PLN-Q | |
15 mL conical tube | SARSTEDT | 62.554.502 | |
Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) | Sima-Aldrich | A2383 | |
Centrifuge | KUBOTA | 2800 | |
Chlamydomonas strain CC-125 | Chlamydomonas Resource Center | https://www.chlamycollection.org/ | |
Creatine kinase | Merck | CK-RO | |
Creatine phosphate | Merck | CRPHO-RO | |
Dithiothreitol (DTT) | Nakalai tesque | 14128-46 | |
GEDTA(EGTA) | Dojindo | G002 | |
Hepes | Dojindo | GB70 | |
Igepal CA-630 | Sigma-Aldrich | I8896 | IUPAC name is octylphenoxypolyethoxyethanol: IGEPAL CA-630 is a substitute for Nonidet P-40 (NP-40); NP-40 is no longer available in Sigma-Aldrich. |
MgSO4-7H2O | Nakalai tesque | 21002-85 | |
Microscope | Olympus | BX-53 | |
Pasteur pipette | fisher scientific | 13-678-20C | |
Polyethylene glycol, Mr 20,000 | Merck | 8.18897.1000 | |
Pottasium acetate | Nakalai tesque | 28434-25 | |
Sodium Hydroxide | Nacalai | 31511-05 | |
Sucrose | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 196-00015 |