إعادة تنشيط الخلايا المتحركة في المختبر هي تجربة حاسمة في فهم آليات حركة الخلايا. يصف البروتوكول إعادة تنشيط نماذج الخلايا المخروطنة من Chlamydomonas reinhardtii ، وهو كائن حي نموذجي لدراسة الأهداب / السوط.
منذ التجربة التاريخية على تقلص العضلات المغلورة عن طريق إضافة ATP ، والتي أظهرها Szent-Györgyi في منتصف القرن 20th ، في المختبر إعادة تنشيط الخلايا المخربة كانت طريقة تقليدية وقوية لفحص حركة الخلية. الميزة الأساسية لهذه الطريقة التجريبية هي أن تكوين حل إعادة التنشيط يمكن تغييره بسهولة. على سبيل المثال ، يمكن تكرار بيئة تركيز Ca2+ عالية المستوى تحدث مؤقتا فقط بسبب إثارة الغشاء في الجسم الحي في المختبر. الأهداب حقيقية النواة (المعروفة أيضا باسم السوط) هي آلية حركية معقدة لا يزال يتعين توضيح آلياتها التنظيمية. الطحالب الخضراء أحادية الخلية Chlamydomonas reinhardtii هي كائن حي نموذجي ممتاز في مجال أبحاث الأهداب. وقد ساهمت تجارب إعادة التنشيط باستخدام نماذج الخلايا غير المخربة من C. reinhardtii ومشتقاتها ، مثل axonemes deembranated من الأهداب المعزولة ، بشكل كبير في فهم الآليات الجزيئية للحركة الهدبية. أوضحت تلك التجارب أن ATP ينشط الحركة الهدبية وأن الإشارات الخلوية المختلفة ، بما في ذلك Ca2 + و cAMP وأنواع الأكسجين التفاعلية ، تعدل الحركات الهدبية. يتم وصف الطريقة الدقيقة لإزالة الترشيح لخلايا C. reinhardtii وإعادة تنشيط نماذج الخلايا هنا.
تعد إعادة تنشيط الخلايا المتحركة المزخرفة في المختبر أداة قيمة لدراسة الأساس الجزيئي للآلية التنظيمية لحركية الخلية. أظهر Szent-Györgyi لأول مرة في المختبر تقلص ألياف العضلات الهيكلية للأرانب المستخرجة من الجلسرين بنسبة 50٪ عن طريق إضافة الأدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP)1. كانت هذه التجربة هي الأولى التي تثبت أن ATP ينشط تقلص العضلات. وسرعان ما طبقت المنهجية على دراسة الحركة الهدبية/السوطية المنشطة من قبل ATP، مثل سوط الحيوانات المنوية2، وأهداب باراميسيوم 3، وأهداب الكلاميدوموناس رينهاردتي (وتسمى أيضا السوط)4 باستخدام منظفات غير أيونية لإزالة الثقب.
الطحالب الخضراء أحادية الخلية C. reinhardtii هي كائن حي نموذجي لدراسة الأهداب: فهي تسبح مع اثنين من الأهداب عن طريق ضربها مثل ضربة صدر الإنسان5. يتم تشغيل الحركة الهودية بواسطة الداينين ، وهو بروتين حركي قائم على الأنابيب الدقيقة موجه في النهاية 6,7. يمكن تصنيف الداينات الهدبية إلى داينيات خارجية الذراع وداينات داخل الذراع. تم عزل المتحورات التي تفتقر إلى كل نوع من أنواع الداينين كمتحولات بطيئة السباحة مع تشوهات حركية مختلفة. وقد أدى التحليل الحركي المفصل في المختبر لهذه الطفرات إلى تقدم كبير في أبحاث الداينين8.
تم التوصل إلى العديد من النتائج الهامة باستخدام هذه الطريقة ومشتقاتها منذ إنشاء تجربة إعادة التنشيط في المختبر لخلايا C. reinhardtii (نماذج الخلايا). على سبيل المثال ، أظهرت إعادة تنشيط نماذج الخلايا في سلسلة من المخازن المؤقتة Ca 2 +9 أن اثنين من الأهداب يتم تنظيمهما بشكل مختلف بواسطة ca2 + تحت micromolar ، وهذا التحكم غير المتماثل في الأهداب يمكن من التوجيه الضوئي ل C. reinhardtii10. علاوة على ذلك، تظهر كل من الأهداب تحويل الشكل الموجي من وضع السباحة الأمامي (يسمى الشكل الموجي غير المتماثل) إلى وضع السباحة الخلفي (يسمى الشكل الموجي المتماثل الذي يظهر لفترة قصيرة عندما تكون الخلايا مصدومة) 11،12. يتم تنظيم هذا التحويل الموجي بواسطة Ca2+ تحت الملليمولي ، والذي ظهر من خلال إعادة تنشيط ما يسمى بجهاز السوط النووي (وهو مجمع يحتوي على أهداب ، والأجسام القاعدية ، والهياكل التي تربط الأجسام القاعدية بالنواة ، وبقايا النواة)11 أو المحاور غير المخروطنة للأهداب المعزولة13. بخلاف Ca2+ ، فإن اتزان الأكسدة والاختزال (الحد من الأكسدة) هو إشارة تنظم تردد الضرب الهدبي ، والذي تم إظهاره من خلال إعادة تنشيط نماذج الخلايا في مخازن الأكسدة والاختزال التي تحتوي على نسب مختلفة من الجلوتاثيون المنخفض مقابل الجلوتاثيون المؤكسد14. بالإضافة إلى ذلك ، ينظم أحادي فوسفات الأدينوسين الدوري (cAMP) بشكل غير متماثل اثنين من الأهداب ، والتي ظهرت من خلال إعادة تنشيط axonemes مع cAMP15 المحبوس القابل للانقسام الضوئي. وقد أدت هذه النتائج في المختبر ، جنبا إلى جنب مع النتائج الجينية ، إلى فهم أعمق للآليات الجزيئية لتنظيم الأهداب في C. reinhardtii.
يتم وصف بروتوكول لإعادة تنشيط نماذج الخلايا هنا. هذه الطريقة بسيطة ، وتسمح بإجراء تعديلات مختلفة ، ويمكن تطبيقها على كائنات حية متعددة تتحرك مع الأهداب. ومع ذلك ، نظرا لأن الخلايا المزروعة هشة ، فإنها تتطلب بعض النصائح لإعادة تنشيط حركة نماذج الخلايا بكفاءة جيدة مع منع الإهلاك.
هناك خطوتان حاسمتان في هذا البروتوكول. الأول هو عملية تعرف باسم إزالة النخاع ، والتي يجب تنفيذها بلطف ولكن بدقة. يحدث التفكيك (أي فصل الأهداب عن جسم الخلية) عن طريق السحب القوي أو الدوامة ، مما يجعل نماذج الخلايا غير متحركة حتى بعد إضافة ATP. عادة ، يتم تعليق 5 × 107 خلايا في ~ 0.5 مل من المخز?…
The authors have nothing to disclose.
تم دعم هذه الدراسة من خلال منح من الجمعية اليابانية لتعزيز العلوم KAKENHI (https://www.jsps.go.jp/english/index.html) إلى جامعة الأمم المتحدة (19K23758 ، 21K06295) و K.W. (19H03242 ، 20K21420 ، 21H00420) ، من مؤسسة Ohsumi Frontier Science Foundation (https://www.ofsf.or.jp/en/) إلى K.W. ، ومن التحالف الديناميكي للابتكار المفتوح الذي يربط بين الإنسان والبيئة والمواد (http://alliance.tagen.tohoku.ac.jp/english/) إلى N.U. و K.W. ونشكر السيدة ميوكي شينوهارا (جامعة هوسي) على مساعدتها في إعداد الأرقام.
0.5 mL plastic tube | QSP | 502-PLN-Q | |
15 mL conical tube | SARSTEDT | 62.554.502 | |
Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) | Sima-Aldrich | A2383 | |
Centrifuge | KUBOTA | 2800 | |
Chlamydomonas strain CC-125 | Chlamydomonas Resource Center | https://www.chlamycollection.org/ | |
Creatine kinase | Merck | CK-RO | |
Creatine phosphate | Merck | CRPHO-RO | |
Dithiothreitol (DTT) | Nakalai tesque | 14128-46 | |
GEDTA(EGTA) | Dojindo | G002 | |
Hepes | Dojindo | GB70 | |
Igepal CA-630 | Sigma-Aldrich | I8896 | IUPAC name is octylphenoxypolyethoxyethanol: IGEPAL CA-630 is a substitute for Nonidet P-40 (NP-40); NP-40 is no longer available in Sigma-Aldrich. |
MgSO4-7H2O | Nakalai tesque | 21002-85 | |
Microscope | Olympus | BX-53 | |
Pasteur pipette | fisher scientific | 13-678-20C | |
Polyethylene glycol, Mr 20,000 | Merck | 8.18897.1000 | |
Pottasium acetate | Nakalai tesque | 28434-25 | |
Sodium Hydroxide | Nacalai | 31511-05 | |
Sucrose | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 196-00015 |