運動性細胞の インビトロ 再活性化は、細胞運動性のメカニズムを理解する上で重要な実験である。このプロトコルは、繊毛/鞭毛を研究するためのモデル生物である クラミドモナス・ラインハルティイの膜除去細胞モデルの再活性化を記述している。
Szent-Györgyiが20世紀半ばに実証したATP添加によるグリセリン化筋肉の収縮に関する歴史的な実験以来、脱膜細胞のインビトロ再活性化は、細胞運動性を調べるための伝統的かつ強力な方法であった。この実験方法の基本的な利点は、再活性化溶液の組成を容易に変更できることである。例えば、生体内の膜励起のために一時的にしか起こらない高Ca2+濃度環境を実験室で再現することができる。真核生物の繊毛(別名鞭毛)は精巧な運動機構であり、その調節機構はまだ明らかにされていない。単細胞緑藻クラミドモナス・ラインハルティイは、繊毛の研究分野における優れたモデル生物である。単離繊毛の脱膜軸索などのC. reinhardtiiおよびその誘導体の膜除去細胞モデルを用いた再活性化実験は、毛様体運動の分子機構の理解に大きく貢献している。これらの実験により、ATPが毛様体運動を活性化し、Ca2+、cAMP、活性酸素種を含む様々な細胞シグナルが毛様体運動を調節することが明らかになりました。C. reinhardtii細胞のデメンブラネーションおよび細胞モデルの再活性化のための正確な方法をここで説明する。
脱膜された運動性細胞のインビトロ再活性化は、細胞運動性の調節機構の分子基盤を研究するための貴重なツールである。Szent-Györgyiは、アデノシン三リン酸(ATP)1を添加することにより、50%グリセロールで抽出したウサギ骨格筋線維のインビトロ収縮を初めて実証した。この実験は、ATPが筋肉の収縮にエネルギーを与えることを証明した最初の実験でした。この方法論は、精子鞭毛2、ゾウリムシ繊毛3、クラミドモナス・ラインハルティイ繊毛(鞭毛とも呼ばれる)4などのATP活性化毛様体/鞭毛運動性の研究にすぐに適用され、非イオン性洗剤を用いてデメンブラネーションに使用されました。
単細胞緑藻 C. reinhardtii は繊毛を研究するためのモデル生物です:それは人間の平泳ぎのようにそれらを打つことによって2つの繊毛で泳ぎます5.毛様体運動は、マイナス末端指向性微小管ベースの運動タンパク質であるダイニン6,7によって駆動される。毛様体ダイニンは、外腕ダイニンと内腕ダイニンに分類することができる。各種類のダイニンを欠く変異体は、運動異常の異なる遅泳変異体として単離されている。これらの変異体の詳細なインビトロ運動性解析は、ダイニン研究を著しく進歩させた8。
この方法およびその誘導体を利用して、脱膜化C.ラインハルティイ細胞のin vitro再活性化実験(細胞モデル)が確立されて以来、多くの重要な知見が達成されてきた。例えば、一連のCa2+緩衝液における細胞モデルの再活性化は、2つの繊毛がサブマイクロモルCa2+によって異なる調節されることを9示し、この非対称繊毛制御は、C. reinhardtii10の光戦術配向を可能にする。さらに、両方の繊毛は、順方向遊泳モード(非対称波形と呼ばれる)から後方遊泳モード(細胞が光またはメカノショックを受けたときに短時間現れる対称波形と呼ばれる)への波形変換を示す11,12。この波形変換は、サブミリモルCa2+によって調節され、これは、いわゆる核鞭毛装置(2つの繊毛、基底体、基底体と核をつなぐ構造、および核の残骸を含む複合体)11または単離繊毛13の膜除去された軸索の再活性化によって示された。Ca2+以外に、酸化還元(還元酸化)ポイズは毛様体拍動頻度を調節するシグナルであり、これは還元型グルタチオン対酸化型グルタチオンの異なる比率を含む酸化還元緩衝液中の細胞モデルの再活性化によって示された14。さらに、環状アデノシン一リン酸(cAMP)は2つの繊毛を非対称に調節し、これは光切断可能なケージcAMP15による軸索の再活性化によって示された。これらのインビトロでの知見は、遺伝的知見と相まって、C. reinhardtiiにおける繊毛調節の分子機構のより深い理解につながった。
ここでは、細胞モデルを再アクティブ化するためのプロトコルについて説明します。この方法は簡単で、様々な改変を可能にし、繊毛とともに移動する複数の生物に適用することができる。しかし、脱膜細胞は壊れやすいため、脱毛を防ぎながら細胞モデルの運動性を良好な効率で再活性化するには、いくつかのヒントが必要です。
このプロトコルには 2 つの重要な手順があります。1つ目は、デメンブラネーションとして知られるプロセスであり、穏やかに、しかし徹底的に実行する必要があります。脱鼠(すなわち、細胞体からの繊毛の剥離)は、激しいピペッティングまたはボルテックスによって誘導され、ATPの添加後でさえも細胞モデルを不動にする。典型的には、5×107 個の細胞を〜0.5mLのデメンブラン化緩?…
The authors have nothing to disclose.
本研究は、日本学術振興会(https://www.jsps.go.jp/english/index.html)からN.U.(19K23758, 21K06295)およびK.W.(19H03242, 20K21420, 21H00420)への助成金、財団法人大隅フロンティアサイエンス財団(https://www.ofsf.or.jp/en/)から株式会社への助成金、および http://alliance.tagen.tohoku.ac.jp/english/ からN.U.およびK.W.への人的・環境・材料架け橋活動連携(Dynamic Alliance for Open Innovation Bridge Human and Environment and Materials)からの助成金によって支援されました。篠原みゆきさん(法政大学)がフィギュア作成に協力してくれたことに感謝します。
0.5 mL plastic tube | QSP | 502-PLN-Q | |
15 mL conical tube | SARSTEDT | 62.554.502 | |
Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) | Sima-Aldrich | A2383 | |
Centrifuge | KUBOTA | 2800 | |
Chlamydomonas strain CC-125 | Chlamydomonas Resource Center | https://www.chlamycollection.org/ | |
Creatine kinase | Merck | CK-RO | |
Creatine phosphate | Merck | CRPHO-RO | |
Dithiothreitol (DTT) | Nakalai tesque | 14128-46 | |
GEDTA(EGTA) | Dojindo | G002 | |
Hepes | Dojindo | GB70 | |
Igepal CA-630 | Sigma-Aldrich | I8896 | IUPAC name is octylphenoxypolyethoxyethanol: IGEPAL CA-630 is a substitute for Nonidet P-40 (NP-40); NP-40 is no longer available in Sigma-Aldrich. |
MgSO4-7H2O | Nakalai tesque | 21002-85 | |
Microscope | Olympus | BX-53 | |
Pasteur pipette | fisher scientific | 13-678-20C | |
Polyethylene glycol, Mr 20,000 | Merck | 8.18897.1000 | |
Pottasium acetate | Nakalai tesque | 28434-25 | |
Sodium Hydroxide | Nacalai | 31511-05 | |
Sucrose | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 196-00015 |