Bildgebung der Migration von Neutrophilen in der Maushaut zur Untersuchung des subzellulären Membranumbaus unter physiologischen Bedingungen

Summary

Die Migration von Neutrophilen beruht auf dem schnellen und kontinuierlichen Umbau der Plasmamembran als Reaktion auf den Chemolockstoff und seine Wechselwirkungen mit der extrazellulären Mikroumgebung. Hierin wird ein Verfahren beschrieben, das auf der Intravitalen Subzellulären Mikroskopie basiert, um die Dynamik des Membranumbaus bei Neutrophilen zu untersuchen, die in das Ohr von anästhesierten Mäusen injiziert werden.

Abstract

Die Erforschung der Rekrutierung und Funktion von Immunzellen in Geweben war in den letzten zwei Jahrzehnten ein sehr aktives Feld. Neutrophile Zellen gehören zu den ersten Immunzellen, die den Ort der Entzündung erreichen und an der angeborenen Immunantwort während einer Infektion oder Gewebeschädigung teilnehmen. Bisher wurde die Migration von Neutrophilen erfolgreich mit verschiedenen experimentellen In-vitro-Systemen visualisiert, die auf einer einheitlichen Stimulation oder einer eingeschlossenen Migration unter Agarose oder mikrofluidischen Kanälen basieren. Diese Modelle rekapitulieren jedoch nicht die komplexe Mikroumgebung, in der Neutrophile in vivo vorfinden. Die Entwicklung von auf Multiphotonenmikroskopie (MPM) basierenden Techniken, wie z. B. die intravitale subzelluläre Mikroskopie (ISMic), bietet ein einzigartiges Werkzeug, um die Dynamik von Neutrophilen bei subzellulärer Auflösung unter physiologischen Bedingungen zu visualisieren und zu untersuchen. Insbesondere das Ohr einer lebend anästhesierten Maus bietet aufgrund seiner einfachen Zugänglichkeit und der fehlenden chirurgischen Exposition einen experimentellen Vorteil, um die interstitielle Migration von Neutrophilen in Echtzeit zu verfolgen. ISMic bietet die optische Auflösung, Geschwindigkeit und Erfassungstiefe, die erforderlich sind, um sowohl zelluläre als auch vor allem subzelluläre Prozesse in 3D über die Zeit (4D) zu verfolgen. Darüber hinaus kann die multimodale Bildgebung der interstitiellen Mikroumgebung (d. h. Blutgefäße, residente Zellen, extrazelluläre Matrix) leicht mit einer Kombination aus transgenen Mäusen, die ausgewählte Fluoreszenzmarker exprimieren, exogener Markierung über Fluoreszenzsonden, intrinsischer Gewebefluoreszenz und erzeugten Signalen der zweiten/dritten Harmonischen durchgeführt werden. Dieses Protokoll beschreibt 1) die Vorbereitung von Neutrophilen für den adoptiven Transfer in das Mausohr, 2) verschiedene Einstellungen für eine optimale subzelluläre Bildgebung, 3) Strategien zur Minimierung von Bewegungsartefakten bei gleichzeitiger Aufrechterhaltung einer physiologischen Reaktion, 4) Beispiele für Membranumbau, die bei Neutrophilen mit ISMic beobachtet wurden, und 5) einen Arbeitsablauf für die quantitative Analyse des Membranumbaus bei migrierenden Neutrophilen in vivo.

Introduction

Die gerichtete Zellmigration ist ein kritisches Ereignis, das während verschiedener physiologischer und pathologischer Prozesse auftritt, einschließlich Entwicklung, Immunantwort, Gewebereparatur sowie Tumorinitiierung, -progression und -verbreitung ^1,2. Dieser Prozess beruht auf spezifischen extrazellulären chemotaktischen Signalen, die von ihren verwandten Rezeptoren an der Plasmamembran wahrgenommen und dann in komplizierte intrazelluläre Signale umgewandelt werden. Diese Signalwege wiederum aktivieren die Zellmigration durch eine Reihe von Reaktionen, darunter die lokale Aktivierung des Zytoskeletts, Membrantransport und -umbau sowie die Zellpolarisation³. Zwei unterschiedliche Arten der Zellmigration wurden gut charakterisiert: mesenchymale und amöboide⁴. Die mesenchymale Migration ist relativ langsam (10 μm/min) und nutzt schwache Adhäsionen, um durch die EZM zu navigieren. Unabhängig von der Modalität erfordert die Zellmigration einen ständigen Umbau der Plasmamembran, was zur Bildung von protrusiven Strukturen an der Vorderkante der Zellen führt, die eng mit der Retraktion der Membran an der Rückseite koordiniert sind¹.

Um die molekularen Mechanismen zu entschlüsseln, die diesen subzellulären Prozessen zugrunde liegen, ist es von grundlegender Bedeutung, die Dynamik der Membranen in wandernden Zellen mit einer angemessenen zeitlichen und räumlichen Auflösung sichtbar zu machen. Da der Membranumbau stark von den Eigenschaften der Mikroumgebung des Gewebes beeinflusst wird, die die wandernden Zellen umgibt, ist es außerdem von entscheidender Bedeutung, diesen Prozess direkt im nativen Gewebe, in lebenden Tieren, abzubilden. Dies wird durch den Einsatz der Intravitalmikroskopie (IVM)⁵ erreicht. Die allererste IVM-Bildgebung wurde vor ~200 Jahren durchgeführt, als die Leukozytenextravasation mit einem einfachen Trans-Illuminationsmikroskop⁶ sichtbar gemacht wurde, und danach wurde die IVM hauptsächlich an halbtransparenten Modellorganismen wie Zebrafischen und Drosophila eingesetzt ^7,8. In den letzten zwei Jahrzehnten wurde die IVM erfolgreich eingesetzt, um zelluläre Prozesse bei Mäusen, Ratten und größeren Säugetieren wie Schweinen zu untersuchen ^5,9. Möglich wurde dies durch 1) bedeutende Entwicklungen in der konfokalen und Multiphotonenmikroskopie (MP) und 2) die Entwicklung von Gen-Editing-Technologien wie CRISPR-Cas9, die die schnelle Entwicklung einer Vielzahl von Tiermodellen zur Expression fluoreszenzmarkierter Proteine und Reporter ermöglicht haben. Darüber hinaus wurde die Visualisierung einzelner Zellen und ihrer Mikroumgebung während Prozessen wie der Tumorinitiierung, der Zellmigration und der Immunantwort sowohl durch andere Formen der exogenen Markierung, wie die systemische Einführung von Farbstoffen zur Markierung des Gefäßsystems^10,11, als auch durch die Anregung endogener Moleküle, wie z.B. Kollagen durch die Zweite Harmonische Generation (SHG)^{10, ermöglicht. 12} und Nervenfasern durch die Dritte Harmonische Generation (THG)^11,13. Schließlich hat eine Verbesserung der Techniken zur Minimierung von Bewegungsartefakten aufgrund von Herzschlag und Atmung zur Entwicklung der intravitalen subzellulären Mikroskopie (ISMic) geführt, die es den Forschern ermöglicht hat, mehrere subzelluläre Ereignisse direkt in lebenden Tieren mit einer ähnlichen Auflösung wie in vitro abzubilden und zu untersuchen ^14,15,16,17. Beispiele für ISMic sind die Untersuchung der Zytoskelettdynamik während der Exozytose 14,15,16,17 und Endozytose¹⁵, der dynamische Umbau des Zytoskeletts während der Zellmigration ^17,18, die mitochondriale Lokalisation und der Metabolismus^19,20 und die Kalziumsignalisierung im Gehirn 21.

Dieses Protokoll beschreibt die verschiedenen Schritte und Verfahren zur Untersuchung des Zellmembranumbaus bei subzellulärer Auflösung während der Migration von Neutrophilen in der Ohrhaut einer lebenden Maus mit ISMic. Dieser Ansatz basiert auf den zuvor beschriebenen Protokollen^22,23 und ist angepasst, um eine höhere räumliche und zeitliche Auflösung zu erreichen.

Protocol

Alle Tierversuche und -verfahren wurden vom Animal Care and Use Committee des National Cancer Institute (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA) genehmigt (Protokolle LCMB-031 und LCMB-035) und entsprachen allen relevanten ethischen Vorschriften. Für die Experimente wurden sowohl männliche als auch weibliche Mäuse im Alter zwischen 2 und 6 Monaten verwendet. mT/mG – und Wildtyp-Wirtsmäuse (WT) befinden sich in einem FVB/NJ-Hintergrund, während sich LyzM-Cre x mTmG-Mäuse in einem C57BL/6-Hintergrund befinden. 1. Materialien und Vorbereitung der Reagenzien und Werkzeuge Röhrchen, Schalen und Nadeln/Spritzen über Nacht unter Rühren mit PBS + 1% BSA (ohne Calcium und Magnesium) bestreichen. Reinigen Sie Oberflächen und Werkzeuge/Instrumente, die für die Tierarbeit verwendet werden sollen, sorgfältig mit 70%igem Ethanol oder durch Autoklavieren.Für die Aufreinigung von Neutrophilen bereiten Sie Folgendes vor: 3 x 15 mL Röhrchen, 1 x 60 mm Schale, 1 x 1,5 mL Röhrchen; HBSS mit 10 mM HEPES (pH 7,3); Lyselösung für rote Blutkörperchen (ACK); Histopak 1077; und Histopaque 1119. Für Neutrophilen-Injektionen bereiten Sie Folgendes vor: 1 x Spritze mit geringem Volumen (10 μl), 1 x 33 g abgeschrägte Nadel, Isofluran und Anästhesielösung (Ketamin, Xylazin und Acepromazin in einer Dosis von 80 mg-kg-1, 2 mg-kg-1 bzw. 4 mg-kg-1 in Kochsalzlösung). 2. Aufreinigung von Neutrophilen aus einer Spendermaus Euthanasieren Sie die Spendermaus gemäß den örtlichen institutionellen Vorschriften. Sammeln Sie lange Knochen des Tieres (Femur, Tibia und Humerus), achten Sie darauf, die Knochenintegrität zu erhalten und vermeiden Sie es, die Knochenköpfe während der Entnahmezu schneiden 24. In einer BSA-beschichteten 60-mm-Schale Muskeln und Fettgewebe entfernen. Schneiden Sie die Knochenköpfe ab, um Zugang zum Knochenmark zu erhalten, und spülen und homogenisieren Sie das Knochenmark dann mit einer mit HBSS gefüllten Spritze (27 G-Nadel). Die Lösung wird mit einem 40-μm-Sieb in ein 15 mL BSA-beschichtetes Röhrchen filtriert und bei 400 x g für 5 min bei Raumtemperatur (RT) zentrifugiert. Aspirieren Sie den Überstand, resuspendieren Sie das Pellet 30 s lang in 1 ml ACK, um die roten Blutkörperchen zu lysieren, und fügen Sie dann 9 ml HBSS hinzu, um die Lyse zu stoppen. Zentrifugieren Sie die Lösung bei 400 x g für 5 min bei RT. Bereiten Sie einen Dichteschrittgradienten in einem 15 mL BSA-beschichteten Röhrchen vor, indem Sie vorsichtig 4 mL 1119 Histopaque auf den Boden des Röhrchens legen und dann vorsichtig 4 mL 1077 Histopaque auf die Oberseite schichten. Achten Sie besonders darauf, dass Sie die beiden Schichten nicht vermischen. Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 2 mL HBSS. Schichten Sie die Lösung vorsichtig auf den oben vorbereiteten Stufengradienten. Schleudern Sie bei 1.000 x g für 30 min bei RT mit der geringstmöglichen Beschleunigungs- und Verzögerungsgeschwindigkeit (“keine Bremse” wird bevorzugt). Saugen Sie von der Oberseite des Rohrs vorsichtig die Hälfte der 1077 Histopaque-Schicht an. Sammeln Sie die verbleibende Hälfte der 1077 Histopaque-Schicht und die obere Hälfte der 1119 Histopaque-Schicht in einem frischen, BSA-beschichteten Rohr. Die trübe Zellsuspension zwischen den beiden Dichteschichten enthält überwiegend Neutrophile. Fügen Sie HBSS hinzu, um ein Endvolumen von 15 mL zu erreichen, und mischen Sie vorsichtig, indem Sie das Röhrchen umdrehen. Bei 400 x g für 5 min bei RT drehen. Nach der Zentrifugation das Zellpellet resuspendieren und mit 10 mL HBSS waschen und bei 400 x g 5 min bei Raumtemperatur schleudern. Wiederholen Sie den Vorgang und resuspendieren Sie dann das Pellet in 15 ml HBSS, um die Anzahl der Zellen mit einem Zellzähler zu bestimmen. Zum Schluss werden die Zellen in 1 ml HBSS gedreht und resuspendiert und in ein 1,5 mL BSA-beschichtetes Röhrchen überführt. Nach der Reinigung ist die Neutrophilensuspension in dem BSA-beschichteten Röhrchen 30 Minuten lang auf einem Röhrchenrotator bei RT bis zur Markierung und/oder Injektion unter sanftem Rühren zu halten.HINWEIS: Eine erfolgreiche Aufreinigung ergibt 10-20 x 106 Neutrophile pro Maus mit einer Reinheit von 95%. Die Reinheit wird mittels Durchflusszytometrie unter Verwendung der zuvor beschriebenen Neutrophilenmarker (Ly6G+, Ly6C-, Gr1+ und CD11b+)25,26 bestimmt.HINWEIS: Protokolle zur Aufreinigung von Neutrophilen aus dem peripheren Blut des Menschen und dem Knochenmark der Maus sind bereits verfügbar24,27. 3. Markierung von Neutrophilen HINWEIS: Um die Neutrophilen sichtbar zu machen, wurden sie von LyzM-Cre mT/mG-Mäusen gereinigt, in denen myeloische Zellen ein membrangesteuertes Peptid exprimieren, das mit dem GFP fusioniert ist. Zusätzlich wurden gereinigte Neutrophile von Wildtyp-Mäusen (WT) in vitro markiert. Die folgenden Schritte beschreiben das Verfahren zur Markierung gereinigter Neutrophiler mit einem kommerziellen zellpermeablen grünen Fluoreszenzfarbstoff und können an jede andere MPM-kompatible Fluoreszenzsonde der Wahl angepasst werden. Geben Sie den grünen Fluoreszenzfarbstoff (die vom Hersteller empfohlene Konzentration; hier 1 μM) in ein 1,5 mL BSA-beschichtetes Röhrchen zur Neutrophilensuspension (gereinigt von WT-Maus). 30 min bei RT unter sanftem Rühren in einem Röhrchenrotator inkubieren. Dreimal mit HBSS waschen, bei 400 x g für 5 min bei RT schleudern und das Pellet in 1 mL HBSS resuspendieren. Halten Sie die Neutrophilensuspension in dem BSA-beschichteten Röhrchen unter sanftem Rühren in einem Röhrchenrotator bei RT bis zum Injektionsvorgang.HINWEIS: Die Injektion von markierten Neutrophilen, die direkt nach der Markierung durchgeführt wird, wird dringend bevorzugt. Falls erforderlich, können markierte Neutrophile jedoch für weitere 10-15 Minuten nach der Markierung unter Bewegung gehalten werden, ohne die Integrität der Neutrophilenreaktion in vivo zu beeinträchtigen. Langfristiges Rühren (mehr als 60 Minuten nach der Markierung) führt zu Verklumpung, Absterben von Neutrophilen und irreführenden Beobachtungen in vivo. Kurz vor der Injektion resuspendieren Sie das Zellpellet in Kochsalzlösung, um eine Dichte von 2-5 x 106 Zellen pro 20 μl zu erreichen. 4. Neutrophilen-Injektion HINWEIS: Die Anästhesie muss gemäß den Richtlinien des örtlichen institutionellen Ausschusses für Tierpflege und -verwendung durchgeführt werden. Setzen Sie das Tier in eine geschlossene Kammer und verabreichen Sie 3%-5% Isofluran (Durchflussrate von 2 l/min) mit einem kalibrierten Verdampfer, der an einen Sauerstoffkonzentrator angeschlossen ist. Beurteilen Sie, ob das Tier bewusstlos ist, indem Sie den Rückzugsreflex der Pfoten beim Einklemmen des Hinterfußballens testen. Legen Sie das Tier dann auf ein Wärmekissen (37° C), um seine Körpertemperatur zu halten. Verabreichen Sie weiterhin das Isofluran (1%-2%; Durchflussrate von 0,5 l/min) durch einen Nasenkonus.SICHERHEITSHINWEIS: Um die Exposition des Personals gegenüber giftigem Isofluran zu begrenzen, wird die Verwendung eines Spendersystems empfohlen, das mit einer Filtereinheit ausgestattet ist, um zirkulierendes Isofluran zurückzugewinnen. Um die Bildqualität zu optimieren, entfernen Sie die Haare mit einem feinen Trimmer aus dem Ohr. Dieses Verfahren könnte auch ein bis zwei Tage vor dem Experiment durchgeführt werden.HINWEIS: Von der Verwendung von Haarentfernungscreme wird abgeraten, da bekannt ist, dass sie die Entzündungsreaktion in der Maushaut verschlimmert und bildgebende Artefakte hervorruft. Lege das Tier auf die Seite. Halten Sie den Rand des Ohrs mit chirurgischem Klebeband fest und glätten Sie ihn entlang des Wärmekissens. Bringen Sie das Klebeband vorsichtig an, um Schäden am Ohr zu vermeiden. Füllen Sie eine mit einer 33 G Nadel bestückte Spritze mit der Neutrophilensuspension (2-5 x 106 Zellen pro 20 μL) und montieren Sie diese auf einen Mikromanipulator.HINWEIS: Der Injektionswinkel zwischen der Nadel und dem Ohr auf einem Wärmekissen muss zwischen 10° und 30° liegen, um Gewebeschäden zu minimieren und den Erfolg der Zellinjektion zu erhöhen. Bewegen Sie die Nadel vorsichtig (mit der Fase nach oben) in Richtung Ohr und stechen Sie langsam in die Haut. Sobald sich die Nadel in der Haut befindet, drücken Sie langsam auf den Kolben und geben Sie 2-3 μl Zellsuspension ab.HINWEIS: Bereiche mit sichtbaren Blutgefäßen sollten vermieden werden, da die Beschädigung eines Blutgefäßes zu einer unerwünschten und komplexen Immunantwort auf die Injektion und zu Problemen mit der Bildgebung führt. Wiederholen Sie die Injektion in 2-3 verschiedenen Bereichen des Ohrs, vorzugsweise im Abstand von 2-3 mm. “Überfüllen” Sie das Ohr nicht mit der Zellsuspension.HINWEIS: Die Injektion muss in der Mitte des Ohrs durchgeführt werden. Die Peripherie des Ohrs ist dünn und muss mit Vorsicht behandelt werden, da sie leicht beschädigt werden kann, während der mittlere Teil dicker ist und größere Blutgefäße und weniger Haarfollikel enthält und größeren Injektionsvolumina standhalten kann. Entfernen Sie vorsichtig das chirurgische Klebeband und lassen Sie das Tier unter Aufsicht wieder zu Bewusstsein kommen. Lassen Sie das Tier vor der Bildgebung 1 Stunde ruhen, damit sich das Gewebe und die Zellen von der Injektion erholen können. 5. Anästhesie bei IVM HINWEIS: Eine tiefere Anästhesie verbessert die Bildqualität erheblich, indem die Bewegungsartefakte aufgrund von Herzschlag und Atmung verringert werden. Mit Neutrophilen injizierte Mäuse werden einer chemischen Anästhesie unterzogen, die eine tiefere Sedierung als eine gasinduzierte Anästhesie ermöglicht. Die Anästhesie muss gemäß den Richtlinien des örtlichen institutionellen Ausschusses für Tierpflege und -verwendung durchgeführt werden. Eine Stunde nach der Genesung von der Neutrophilen-Injektion betäuben Sie die Tiere durch eine subkutane Injektion, die eine Mischung aus Xylazin/Ketamin/Acepromazin (80 mg-kg-1, 2 mg-kg-1 bzw. 4 mg-kg-1) in Kochsalzlösung enthält.HINWEIS: Um die Reproduzierbarkeit und Zuverlässigkeit der Ergebnisse zu gewährleisten, müssen die Tiere vom Zeitpunkt der Anästhesie bis zum Ende des Versuchs mit einem Heizkissen oder einem Wasserumwälzkissen, das an eine Wärmepumpe angeschlossen ist, warm gehalten werden. Um die Anästhesie über 1 h hinaus aufrechtzuerhalten, injizieren Sie alle 40 Minuten eine Mischung aus Ketamin/Acepromazin (40 mg kg 1 bzw. 2 mg kg 1 ) subkutan. Überwachen Sie anästhesierte Mäuse regelmäßig auf Anzeichen von Bewusstsein, indem Sie den Rückzugsreflex der Pfoten testen. Tragen Sie zusätzlich bei bildgebenden Verfahren, die länger als 1 Stunde dauern, eine sterile, nicht-medikamentöse Augensalbe auf die Augen auf, um ein Austrocknen der Hornhaut während der Anästhesie zu verhindern und die Hydratation des Körpers durch subkutane Injektionen von Kochsalzlösung (200 μl pro Stunde) aufrechtzuerhalten.HINWEIS: Alternativ kann ein digital gesteuertes perfusionsbasiertes System verwendet werden, um eine periodische und reibungslose Injektion der Anästhesielösung und/oder die Bereitstellung von Flüssigkeiten zu gewährleisten. Ein automatisierter Spritzentreiber kann so eingerichtet werden, dass er das gewünschte Anästhesievolumen abgibt und über längere Zeiträume für Feuchtigkeit sorgt. Zu diesem Zweck kann eine geflügelte Infusionsnadel subkutan in die Rückenhaut des Tieres eingeführt und mit chirurgischem Klebeband gesichert werden. 6. Bildgebung HINWEIS: Der Tieraufbau und die hier beschriebenen Bildgebungsparameter sind für ein inverses Multiphotonenmikroskop optimiert, das mit einer einzigen Laserlinie ausgestattet ist, um Emissionen von den verschiedenen Fluorophoren anzuregen und gleichzeitig zu sammeln. Bevor Sie das betäubte Tier auf den Mikroskoptisch legen, stellen Sie sicher, dass das Mikroskop eingeschaltet ist und dass sowohl der Tisch als auch die Linsen auf 37 °C vorgeheizt sind. Decken Sie das Loch auf der Bühne mit einem Glasdeckglas (Dicke #1 oder 1,5) ab, das auf die beheizte Linse ausgerichtet ist. Bewegen Sie das Tier vorsichtig auf die Bühne. Wenn die Bildgebung über einen längeren Zeitraum (>1 h) geplant ist, tragen Sie eine Augensalbe auf und sichern Sie das auf Flügelinfusionen basierende Perfusionssystem wie oben beschrieben. Geben Sie einen Tropfen Kochsalzlösung auf die Mitte des Deckglases und legen Sie das neutrophile Ohr darauf. Glätten Sie das Ohr vorsichtig mit einem sterilen Wattestäbchen in der Mitte des Deckglases, um Lufteinschlüsse zu entfernen.HINWEIS: Das Auftragen von Kochsalzlösung (oder PBS) zwischen Ohr und Deckglas reduziert die Lichtbrechung aufgrund von Lufteinschlüssen und sorgt so für einen gleichmäßigen Brechungsindex und eine hervorragende Bildqualität. Sichern Sie das Ohr, indem Sie ein Holzstäbchen (vom Wattestäbchen entfernt) vorsichtig an die Seite des Ohrs drücken, näher an den Kopf des Tieres und es mit Klebeband verriegeln (Abbildung 1A).HINWEIS: Ein gesicherter Holzstab minimiert Bewegungsartefakte durch Herzschlag und Atmung und erhöht die Bildqualität erheblich. Wichtig ist, dass der Holzstab gerade so fest angezogen werden muss, dass das Ohr stabilisiert wird, ohne die Durchblutung zu beeinträchtigen. Suchen Sie mit dem Mikroskop-Okular einen Interessenbereich und wechseln Sie dann in den Multiphotonen-Erfassungsmodus. Stellen Sie die Laseranregungswellenlänge auf 900-930 nm ein, um die gleichzeitige Erfassung von GFP/grünem Fluoreszenzfarbstoff, mTomate sowie Kollagen-I (über SHG) zu ermöglichen. Stellen Sie die entsprechenden Spiegel und Filterkombinationen auf die Detektoren ein, um das emittierte Licht zu sammeln (Bandpassfilter: Blau = 410-460 nm, Grün = 495-540 nm, Rot = 580-640 nm).HINWEIS: Injizierte Neutrophile Pflanzen, die mit einem grün fluoreszierenden Farbstoff markiert sind, weisen eine starke grüne Fluoreszenz auf, die sie unter dem Mikroskop-Okular sichtbar macht, selbst wenn sie in tiefere Teile des Ohrs injiziert werden. Bestimmen Sie die Einstellung, die für die Hardwarekonfiguration am besten geeignet ist. Auch wenn migrierende Zellen mit einem Intervall von 30 s bis 1 min verfolgt werden können, können subzelluläre Ereignisse mit einer höheren Geschwindigkeit (mindestens <10 s Intervall) abgebildet werden. Im folgenden Beispiel werden zwei verschiedene Bildgebungsaufbauten vorgestellt, um den Unterschied zwischen klassischer IVM und ISMic zu verdeutlichen.Beim klassischen IVM-Ansatz zur Verfolgung der Zellmigration und zur Untersuchung des Wirtsmausgewebes (Abbildung 1) verwenden Sie eine 30-fache Linse und einen Galvo-Scanner mit einer Bildgröße von 512 x 512 Pixeln (Pixelgröße von 0,83 μm) und stellen Sie die Verschiebung der Z-Achse mit dem motorisierten Tisch mit einer Schrittweite von 2 μm ein, was die Abbildung eines 30 μm tiefen Volumens alle 30 s ermöglicht. Verwenden Sie im ISMic-Ansatz zur Abbildung eines hochdynamischen Membranumbaus bei höherer Vergrößerung und Auflösung (Abbildung 2) eine 40-fache Linse und einen Resonanzscanner mit 3-facher Mittelwertbildung und einer Bildgröße von 512 x 512 Pixeln (Pixelgröße von 0,25 μm) und stellen Sie die Verschiebung der Z-Achse mit einem Piezo mit einer Schrittweite von 1 μm ein. Ermöglicht die Bildgebung eines 20 μm tiefen Volumens alle 4-5 s. Lösen Sie die Migration von Neutrophilen aus, indem Sie eine sterile Laserverletzung induzieren. Der Anregungslaser wird mit einer hohen Leistung, die ausreicht, um mindestens 80 mW22 zu erreichen, 10 s lang auf einen schmalen Bereich des Gewebes (20 μm x 20 μm) fokussiert. Identifizieren Sie die laserinduzierte Verletzung durch ihre starken autofluoreszierenden Signale, die in allen Kanälen auftreten, und durch die daraus resultierende Veränderung der Kollagenanordnung (Abbildung 1D).HINWEIS: Um zuverlässige Ergebnisse zu erhalten, muss die Verletzung immer so weit wie möglich von den Blutgefäßen entfernt induziert werden. Wenn sie gerissen werden, beeinträchtigen Blutzellen, die in das Gewebe freigesetzt werden, die Bildgebungsqualität und führen zu einer starken Immunreaktion. Speichern Sie die Daten am Ende des Experiments für weitere Analysen. Euthanasieren Sie das Tier gemäß den örtlichen institutionellen Richtlinien. Bei Bedarf kann Gewebe zur Fixierung und Weiterverarbeitung entnommen werden. 7. Repräsentative Datenanalyse HINWEIS: Die Daten können entweder mit der Mikroskopsoftware, Software von Drittanbietern oder benutzerdefinierten Programmen visualisiert und analysiert werden. Das Verfahren und die verwendeten Werkzeuge hängen von den spezifischen Bedürfnissen der Prüfärzte ab. Hier ist ein Beispiel für einen Arbeitsablauf zur Quantifizierung der Membrankrümmung und der lokalen Flächenänderungen an der Vorder- und Rückseite der wandernden Neutrophilen. Öffnen Sie die Bildgebungsdateien mit Imaris oder Fiji, um die Wanderung der Neutrophilen in 4D zu visualisieren und die Qualität des Experiments zu bestimmen.HINWEIS: Imaris und Fiji können das Bildgebungsformat mehrerer Mikroskopmarken lesen. Verarbeiten Sie die Daten mit den folgenden Schritten, indem Sie benutzerdefinierte MATLAB-Codeskripte ausführen. Lesen Sie die ausgewählten Bildgebungsdateien mit dem Bio-Formats28-Paket für MATLAB. Segmentieren Sie jeden Frame des 3D-Volumens mit dem Otsu-Algorithmus29 , um die einzelnen Zellen zu identifizieren. Verfolgen Sie die identifizierten Objekte anhand des Kriteriums der minimalen Verschiebung30. Bestimmen Sie die aktiven Konturen und Berandungen des Objekts.Generieren Sie eine maximale Projektion für jedes Objekt, das in einem Zeitrahmen identifiziert wurde. Wenden Sie die Funktion bwboundaries in MATLAB auf die max-projection jedes identifizierten Objekts aus Schritt 7.2 an, um 100 Begrenzungspunkte zu generieren. Optimieren Sie die mit dem dynamischen Konturalgorithmus identifizierten Grenzpunkte, um eine Subpixelgenauigkeit31 zu erreichen (Abbildung 3A) unter Verwendung der Funktionen in dem MATLAB-Paket, das über http://www.iacl.ece.jhu.edu/static/gvf/ heruntergeladen wurde. Überlagern Sie die Begrenzungen für das Objekt und den durch die Verfolgung in Schritt 7.3 ermittelten Objektbahnindex mit der maximalen Projektion des Originalbildes, um eine Ausgabe eines 2D-überlagerten Films zur Visualisierung und manuellen Überprüfung zu erzeugen. Wählen Sie im überlagerten Film manuell alle Objekte aus, die als migrierende Zellen identifiziert wurden, indem Sie Objekte, die keine Zellen sind, berührende Objekte und Objekte mit unvollständigen Begrenzungen ausschließen. Zeichnen Sie die Tracking-Indizes, Start- und Endframes jeder Zellenleitkurve in einer Tabellenkalkulation auf, die als Eingabe für die folgenden Schritte verwendet wird, die von MATLAB-Codeskripten implementiert werden. Verfolgen Sie die Zellenbegrenzungspunkte von jedem Frame zum nächsten gemäß dem Kriterium der minimalen Verschiebung. Verwenden Sie die Funktion Polyarea in MATLAB, um die durch benachbarte Grenzpunkte unterstrichene Fläche in zwei aufeinanderfolgenden Zeitrahmen zu berechnen (Abbildung 3C). Wenn sich die lokale Zellengrenze von der Zelle nach außen bewegt, weisen Sie der Bereichsänderung ein positives Vorzeichen zu. Wenn sich die lokale Zellengrenze nach innen zur Zelle bewegt, weisen Sie der Bereichsänderung ein negatives Vorzeichen zu. Messen Sie die lokale Membrankrümmung an jedem Begrenzungspunkt für jeden Rahmen, indem Sie die benachbarten Begrenzungspunkte an einen Kreis anpassen (5 pro Seite; insgesamt 11)32 (Abbildung 3B). Generieren Sie Kymographen mit der Funktion imagesc in MATLAB (Abbildungen 3D,E), um die Veränderungen der subzellulären Merkmale im Laufe der Zeit anzuzeigen und sich auf die Position der Zelle zu beziehen.

Representative Results

Hier werden zwei verschiedene Ergebnissätze vorgestellt, um die klassische IVM und ISMic zu veranschaulichen, die eine zelluläre bzw. subzelluläre Auflösung bieten. Im ersten Beispiel wurden Neutrophile aus einer Wildtyp-Maus (WT) aufgereinigt, mit Cell Tracker Green markiert, um das Zytoplasma zu färben, und in eine transgene Maus injiziert, die ein fluoreszierendes Protein exprimierte, das auf die Plasmamembran abzielt (mTomato-Maus, auch bekannt als mT/mG33, Abbildung 1 und Film 1 und Film 2). Diese Empfängermaus ermöglichte die Visualisierung von strukturellen Merkmalen im Ohrgewebe wie Blutgefäße, ansässige Zellen und Haarfollikel (Abbildung 1C und Film 1) über einen IVM-basierten Ansatz (Schritt 6.8.1). Kollagenfasern, die über SHG nachgewiesen wurden (nachgewiesen bei der halben Wellenlänge der Anregung), wurden in einem komplizierten Netzwerk in der Dermis angeordnet, wo Neutrophile injiziert wurden. Entlang des Randes der Haarfollikel (HF) wurde eine Schicht von Epithelzellen (d.h. Keratinozyten) beobachtet. Gelegentlich wurden Artefakte von Haarresten sichtbar, die zu einer lokalen Vertiefung der Haut führten (H). Die laserinduzierten Verletzungen waren aufgrund ihrer starken Autofluoreszenz, die in allen Kanälen nachgewiesen wurde, und aufgrund der Veränderungen der Kollagenanordnung leicht sichtbar (Abbildung 1D). Eine vollständigere Ansicht der 3D-Architektur der Haut und der Lokalisierung der injizierten Neutrophilen kann in Film 1 genossen werden, der einen Z-Stapel der Haut von der äußeren zur inneren Schicht und ein 3D-Volumen-Rendering darstellt. Die Zeitrafferbildgebung zeigte, dass die Neutrophilen die Ohrhaut beprobten und mit der EZM und dem Wirtsgewebe interagierten (Video 2). Die Bildgebung mit dieser Auflösung und die Erfassung eines Z-Stacks alle 30 s ermöglicht die Zellverfolgung und die Messung von Motilitätsparametern (d. h. Geschwindigkeit und Richtung), aber eine präzise und detaillierte Analyse des Membranumbaus ist bei dieser Auflösung eine Herausforderung. Im zweiten Beispiel wurde der Membranumbau mit dem ISMic-Ansatz (Schritt 6.8.2) unter Verwendung von mGFP-exprimierenden Neutrophilen bewertet, die aus LyzM-cre mT/mG-Mäusen gereinigt und in WT-Tiere injiziert wurden (Abbildung 2A, experimentelles Flussdiagramm). Unter Verwendung des ISMic-Protokolls (Video 3 und Standbilder in Abbildung 2B) und nach Laserverletzung wird ein dynamischer Umbau der Plasmamembran während der Migration beobachtet, und die Bildung von Membranvorsprüngen an der Vorderkante und die Retraktion der Rückseite der Zellen werden deutlich sichtbar gemacht (Abbildung 2 und Video 3). Die Zeitraffersequenzen, die in Film 3 hervorgehoben werden, zeigen die Komplexität der Interaktionen mit dem ECM. Tatsächlich wanderten Neutrophile durch den interstitiellen Raum und bewegten sich entweder entlang der Fasern oder in den Zwischenräumen. Schließlich wurden quantitative Aspekte wie die Krümmungsänderungen und die Flächenänderungen an der Vorder- und Rückseite der Zellen für jeden Zeitpunkt quantifiziert. Am Beispiel der in Abbildung 2B beschriebenen Zelle wurde die lokale Dynamik der Plasmamembran mit Hilfe einer Algorithmus-Pipeline (siehe Schritt 7) analysiert, die auf der Identifizierung von 100 Grenzpunkten unter der Zelloberfläche basiert (Abbildung 3A). Die Änderungen der lokalen Krümmung (Abbildung 3B) und des durch Plasmamembranvorsprünge unterstrichenen Bereichs (Abbildung 3C) wurden für jeden Grenzpunkt berechnet und für jeden Zeitrahmen als Kymographen berichtet (Abbildung 3D,E). Sowohl die Vorder- als auch die Rückseite der Zellen weisen eine höhere Krümmung auf als die Seite der Zellen (Abbildung 3D). Negative Bereichsänderungen (Retraktionen, blaue Bereiche) sind an der Rückseite der Zellen deutlicher als an der Vorderkante, wo die positiven Flächenänderungen stärker ausgeprägt sind (Vorsprünge, rote Bereiche) (Abbildung 3E). Abbildung 1: IVM von Neutrophilen in der Haut des Mausohrs. (A) Schematische Darstellung des Ohraufbaus auf dem Mikroskoptisch. (B) Experimentelles Flussdiagramm. (C) Repräsentatives Bild der Ohrhaut einer mTomato-Maus, der fluoreszenzmarkierte Neutrophile injiziert wurden, mit unterschiedlichen Projektionen. Haarfollikel (HF), Blutgefäß (BV), Epidermis (E), Dermis (D), Basalzellschicht (BCL) und Haarartefakt (aufgrund von Haarresten an der Hautoberfläche, H). (D) Repräsentatives Bild der Haut von Mäusen nach einer sterilen Laserverletzung: blauer Kanal (rechts), grüner und roter Kanal (Mitte), zusammengeführtes Bild (links). Die Verletzung ist auf der linken Seite des Bildes durch eine starke Autofluoreszenzemission sowohl im grünen als auch im roten Kanal sowie durch eine Störung der EZM sichtbar, die durch die Bildung eines Lochs in den Kollagen-I-Fasern beobachtet wird. In C und D, Grün: Neutrophile; Rot: Wirtsgewebe der Maus; Cyan: Kollagen-I SHG. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 2: Zeitraffer der Migration von mGFP-Neutrophilen in einem WT-Mausohr. (A) Experimentelles Flussdiagramm. (B) Repräsentative Standbilder aus Film 3. (C) Volumen-Rendering derselben Zelle zur Visualisierung der 3D-Organisation der Membran. Der Bereich der hohen Membrandynamik wird durch einen Pfeil verdeutlicht (rot für Retraktion und blau für Protrusion). (D) Nahaufnahme und geneigte Visualisierung des gerenderten Zellenvolumens. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 3: Analysepipeline zur Quantifizierung der Membrandynamik, die mit ISMic erfasst wurde. (A) Bestimmung der Zellkontur und Aufteilung der Grenzpunkte (100 Grenzpunkte) zwischen zwei aufeinanderfolgenden Frames für mGFP-Neutrophile, beschrieben in Abbildung 2B. (B) Farbige Berandungen stellen die lokale Membrankrümmung dar, die für jeden Grenzpunkt bestimmt wird. (C) Der lokale Bereich ändert sich zwischen zwei aufeinanderfolgenden Bildern (aktuell: blau und nächste: rot). Die grünen Bereiche stellen die Tracking-Ergebnisse der lokalen Membranbewegung dar. Gelbe Pfeile zeigen die allgemeine Richtung der Membranverschiebung an. (D) Grenzkrümmungskymograph der Zelle im Zeitverlauf. Die vertikale Achse stellt die Indizes der Randpunkte dar, wobei 1 und 100 die Rückseite der Zelle entsprechend ihrer Migrationsrichtung darstellen. (E) Kymograph der lokalen Flächenveränderung, der die Membranprotrusion (rot) und die Membranretraktion (blau) der Zelle im Laufe der Zeit widerspiegelt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Film 1: Grün markierte Neutrophile in einem mTomato-Mausohr mittels IVM sichtbar gemacht. Rot: mTomate Wirtsmausgewebe. Cyan: Kollagen-I SHG; Grün: neutrophil. Bitte klicken Sie hier, um diesen Film herunterzuladen. Film 2: IVM von Neutrophilen, die in die Haut eines mTomato-Mausohrs wandern. Videos sind Projektionen eines Bildstapels mit maximaler Intensität, die für ͂27 min mit einer Bildrate von 5 Bildern/s aufgenommen wurden. Rot: mTomate Wirtsmausgewebe. Cyan: Kollagen-I SHG; Grün: neutrophil. Bitte klicken Sie hier, um diesen Film herunterzuladen. Film 3: ISMic des Membranumbaus während der Migration von Neutrophilen in einem WT-Mausohr. Videos sind Projektionen eines Bildstapels mit maximaler Intensität, die für ͂8 min mit einer Bildrate von 10 Bildern/s aufgenommen wurden. Rot: mTomate Wirtsmausgewebe. Cyan: Kollagen-I SHG; Grün: mGFP-Neutrophile; Hellgrün: ausgeschmolzene Neutrophile. Bitte klicken Sie hier, um diesen Film herunterzuladen.

Discussion

Trotz jahrzehntelanger Fortschritte auf dem Gebiet der Zellmigration und des Membranumbaus haben nur sehr wenige Studien IVM eingesetzt, um subzelluläre Merkmale bei lebenden Tieren sichtbar zu machen. Die in diesem Protokoll beschriebenen Verfahren bieten ein leistungsfähiges Werkzeug, um neue Einblicke in die Migration von Neutrophilen in lebenden Tieren und insbesondere in den Umbau der Plasmamembran während dieses Prozesses zu gewinnen. Dieser Ansatz ermöglicht es, die Migration von Neutrophilen unter physiologischen Bedingungen unter Berücksichtigung der inhärenten Komplexität der Mikroumgebung des Gewebes zu untersuchen. In der Tat ermöglicht die Verwendung von MPM die Visualisierung mehrerer Merkmale innerhalb des Wirtsgewebes durch die Verwendung einer Kombination von Mausstämmen, die ausgewählte Fluoreszenzmarker exprimieren, exogener Gewebemarkierung, Anregung endogener Fluoreszenz und Signalen, die durch SHG oder THG erzeugt werden^12,13.

Ein mögliches Problem, das bei diesem Verfahren zu berücksichtigen ist, sind Lichtschäden. Auch wenn MPM in Bezug auf Photobleichung und Phototoxizität im Allgemeinen sicherer ist als die konfokale Mikroskopie, ist bei der Bildgebung von lebendem Gewebe Vorsicht geboten³⁴. Phototoxizität kann die Ergebnisse drastisch beeinträchtigen, indem sie entweder bildgebende Artefakte erzeugt, die von kleinen hellen Flecken bis hin zu größeren Bereichen geschädigten Gewebes reichen, oder indem sie eine Vielzahl von intrazellulären Signalwegen hemmt/stimuliert. Um Phototoxizität zu verhindern, sollte die Laserleistung auf ein Minimum beschränkt werden, und es müssen geeignete Kontrollen entwickelt werden, um zu überprüfen, ob physiologische Bedingungen eingehalten werden (z. B. Messung des Blutflusses, Sonden auf oxidativen Stress)^35,36. Darüber hinaus werden bei diesem speziellen Verfahren, an dem die Haut beteiligt ist, Albino-Stämme dringend empfohlen, da das Melanin, das bei dunkelhaarigen Tieren vorhanden ist, empfindlicher auf Phototoxizität reagiert 36,37,38.

Zu den Haupteinschränkungen des Verfahrens gehören das verwendete Mikroskopsystem und die Art der Neutrophilen. Obwohl die Verwendung von MPM die Tiefe der Gewebebildgebung im Vergleich zu anderen lichtmikroskopischen Techniken (z. B. Konfokal, Spinning-Disk) erheblich erhöht, ist die Möglichkeit, die subzelluläre Dynamik im Ohr sichtbar zu machen, auf die äußersten Schichten des Gewebes (80-100 μm) beschränkt. Dies ist auf die intensive Lichtstreuung zurückzuführen, die von der dicken ECM-Schicht erzeugt wird und es schwierig macht, die Migration in den tieferen Schichten zu untersuchen. Eine weitere Einschränkung ist die Tatsache, dass Neutrophile sehr kurzlebig sind und nicht lange genug in Kultur gehalten werden können, um Gen-Editing-Techniken durchzuführen. Dies kann überwunden werden, indem Mäuse so verändert werden, dass sie Neutrophile produzieren, denen bestimmte Gene fehlen oder die ausgewählte Mutationen beherbergen, was natürlich die Forschungskosten und die Forschungsdauer erhöht.

Die hier beschriebenen Verfahren sind zwar auf die Untersuchung der Membrandynamik ausgelegt, können aber nicht nur bei Neutrophilen, sondern auch bei anderen Immunzelltypen und wandernden Zellen auf jede zellbiologische Fragestellung zugeschnitten werden. Die Informationen, die durch IVM mit geringer Vergrößerung über zelluläre Verhaltensweisen (z. B. wandernder Phänotyp, Zellgeschwindigkeit und Richtungsabhängigkeit²²) gesammelt wurden, können mit mechanistischen Informationen ergänzt und korreliert werden, die durch ISMic über die Neupositionierung von Organellen, die Proteinsekretion, die Endozytose, die Kerndynamik, die Kalziumdynamik, die Organisation des Zytoskeletts und die Netose gewonnen wurden. Der Einsatz pharmakologischer und/oder genetischer Manipulationen kann die Rolle spezifischer molekularer Signalwege in dem interessierenden Prozess hervorheben, was dies zu einem einzigartigen und sehr leistungsfähigen Ansatz macht.

Materials

1.5 mL tubes	USA Scientific	4036-3204
15 mL tubes	Corning	430766
1 mL syringe	Covidien	8881501400
27 G needle	Kendall	827112
27 G winged infusion set	Terumo	SV*27EL
30x objective	Olympus	UPLSAPO30XS	1.05 NA, silicon oil immersion
40x objective	Olympus	UPLSAPO40XS	1.23 NA, silicon oil immersion
60 mm dishes	Falcon	353002
6 mL syringe	Kendall	8881516937
Acepromazine (10 mg/mL)	Vet one	13985-587-50
ACK lysis buffer	Quality Biological	118-156-101
Balance	AND	EK-1200A
BSA	Sigma Aldrich	A9647
Cell strainer 40 µm	Sigma Aldrich	CLS431750
Fiji	ImageJ	N/A	Image visualization/analysis software
Fluoview Software	Olympus	N/A	Acquisition software
FVB mouse strain	Jackson	N/A	FVB background
Gas Anesthesia system	Patterson veterinary	07-8915712	Link 7 model
Green Cell tracker	Thermo	C2925	Solubilized in cell culture grade DMSO to reach 1 mM concentration (1000x)
Hair removal cream	Nair	N/A
HBSS (w/o Ca2+, Mg2+)	Gibco	14175-095
HEPES 1 M pH 7.3	Quality Biological	118-089-721
Histopaque 1077	Sigma Aldrich	10771-100ML
Histopaque 1991	Sigma Aldrich	11191-100ML
Imaris	Bitplane	N/A	Image visualization/analysis software
Isoflurane	Vet one	13985-528-40
Ketamine (100 mg/mL)	Vet one	13985-584-10
LyzM-cre x mT/mG	generated in the lab	N/A	C57BL/6J background
Manual micromanipulator	WPI	M3301R
MATLAB	MatWorks	N/A	Analysis software
mtomato mouse strain	generated in the lab	N/A	mT/mG, FVB background
Multiphoton laser	Spectra Physics	Insight DS+
Multiphoton Microscope	Olympus	MPE-RS
Nanofil 10 µL syringe	WPI	NANOFIL
Nanofil 33 G needle	WPI	NF33BV-2
Objective heater	Bioptechs	N/A
Objective heater controller	Bioptechs	150803
Ophtalmic ointment	Major	NDC 0904-6488-38
Oxygen concentrator	Caire	VisionAire 5
PBS (w/o Ca2+, Mg2+)	Quality Biological	114-058-131
Saline	Quality Biological	114-055-101
Stage heater	Okolab	N/A
Stage heater controller	Okolab	H401-T
Surgical tape	3M	1538-1	Hypoallergenic
Syringe driver	Harvard Apparatus	PHD Ultra
Warming Pads	Parkland Scientific	A2789B
Warming Pump	Parkland Scientific	TP-700
Xylazine (100 mg/mL)	Vet one	13985-704-10