Beeldvorming van neutrofielenmigratie in de huid van muizen om subcellulaire membraanremodellering onder fysiologische omstandigheden te onderzoeken

Summary

De migratie van neutrofielen is gebaseerd op de snelle en continue hermodellering van het plasmamembraan als reactie op chemoattractant en zijn interacties met de extracellulaire micro-omgeving. Hierin wordt een procedure beschreven op basis van intravitale subcellulaire microscopie om de dynamiek van membraanremodellering te onderzoeken bij neutrofielen die in het oor van verdoofde muizen worden geïnjecteerd.

Abstract

De studie van de rekrutering en functie van immuuncellen in weefsels is de afgelopen twee decennia een zeer actief gebied geweest. Neutrofielen behoren tot de eerste immuuncellen die de plaats van ontsteking bereiken en deelnemen aan de aangeboren immuunrespons tijdens infectie of weefselbeschadiging. Tot nu toe is de migratie van neutrofielen met succes gevisualiseerd met behulp van verschillende in vitro experimentele systemen op basis van uniforme stimulatie, of beperkte migratie onder agarose of microfluïdische kanalen. Deze modellen geven echter geen samenvatting van de complexe micro-omgeving waarmee neutrofielen in vivo te maken krijgen. De ontwikkeling van op multifotonenmicroscopie (MPM) gebaseerde technieken, zoals intravitale subcellulaire microscopie (ISMic), biedt een uniek hulpmiddel om de dynamiek van neutrofielen bij subcellulaire resoluties onder fysiologische omstandigheden te visualiseren en te onderzoeken. Met name het oor van een levend verdoofde muis biedt een experimenteel voordeel om neutrofiele interstitiële migratie in realtime te volgen vanwege de gemakkelijke toegankelijkheid en het ontbreken van chirurgische blootstelling. ISMic biedt de optische resolutie, snelheid en diepte van acquisitie die nodig zijn om zowel cellulaire als, nog belangrijker, subcellulaire processen in 3D in de loop van de tijd (4D) te volgen. Bovendien kan multimodale beeldvorming van de interstitiële micro-omgeving (d.w.z. bloedvaten, residente cellen, extracellulaire matrix) gemakkelijk worden bereikt met behulp van een combinatie van transgene muizen die geselecteerde fluorescerende markers tot expressie brengen, exogene labeling via fluorescerende sondes, intrinsieke fluorescentie van weefsel en tweede/derde harmonische gegenereerde signalen. Dit protocol beschrijft 1) de voorbereiding van neutrofielen voor adoptieve overdracht in het oor van de muis, 2) verschillende instellingen voor optimale subcellulaire beeldvorming, 3) strategieën om bewegingsartefacten te minimaliseren met behoud van een fysiologische respons, 4) voorbeelden van membraanremodellering waargenomen bij neutrofielen met behulp van ISMic, en 5) een workflow voor de kwantitatieve analyse van membraanremodellering bij migrerende neutrofielen in vivo.

Introduction

Gerichte celmigratie is een kritieke gebeurtenis die optreedt tijdens verschillende fysiologische en pathologische processen, waaronder ontwikkeling, immuunrespons, weefselherstel en het initiëren, progressie en verspreiden van tumoren ^1,2. Dit proces is gebaseerd op specifieke extracellulaire chemotactische signalen die worden gedetecteerd door hun verwante receptoren op het plasmamembraan en vervolgens worden omgezet in ingewikkelde intracellulaire signalen. Deze routes activeren op hun beurt celmigratie door middel van een reeks reacties, waaronder lokale activering van het cytoskelet, membraantransport en -hermodellering, en celpolarisatie³. Twee verschillende soorten celmigratie zijn goed gekarakteriseerd: mesenchymaal en amoeboïde⁴. Mesenchymale migratie is relatief traag (10 μm/min) en maakt gebruik van zwakke verklevingen om door de ECM te navigeren. Ongeacht de modaliteit vereist celmigratie een constante hermodellering van het plasmamembraan, wat resulteert in het genereren van uitstekende structuren aan de voorrand van de cellen, die nauw worden gecoördineerd met de terugtrekking van het membraan aan de achterkant¹.

Om de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan deze subcellulaire processen te ontrafelen, is het van fundamenteel belang om de dynamiek van de membranen in migrerende cellen te visualiseren met een passende temporele en ruimtelijke resolutie. Aangezien membraanremodellering sterk wordt beïnvloed door de eigenschappen van de weefselmicro-omgeving die de migrerende cellen omringt, is het bovendien van cruciaal belang om dit proces rechtstreeks in beeld te brengen in het natuurlijke weefsel, bij levende dieren. Dit wordt bereikt door gebruik te maken van intravitale microscopie (IVM)⁵. De allereerste IVM-beeldvorming werd ~200 jaar geleden uitgevoerd, toen de extravasatie van leukocyten werd gevisualiseerd met behulp van een eenvoudige transilluminatiemicroscoop⁶ en daarna werd IVM voornamelijk gebruikt op semi-transparante modelorganismen, zoals zebravissen en Drosophila ^7,8. In de afgelopen twee decennia is IVM met succes gebruikt om cellulaire processen bij muizen, ratten en grotere zoogdieren zoals varkens te onderzoeken ^5,9. Dit werd mogelijk gemaakt door 1) belangrijke ontwikkelingen in confocale en multi-foton (MP) microscopie en 2) de opkomst van genbewerkingstechnologie zoals CRISPR-Cas9, die de snelle engineering van een verscheidenheid aan diermodellen mogelijk heeft gemaakt om fluorescerend gelabelde eiwitten en reporters tot expressie te brengen. Bovendien is de visualisatie van individuele cellen en hun micro-omgeving tijdens processen zoals tumorinitiatie, celmigratie en immuunrespons mogelijk gemaakt door zowel andere vormen van exogene etikettering, zoals de systemische introductie van kleurstoffen om het vaatstelsel te labelen ^10,11, als de excitatie van endogene moleculen, zoals collageen door Second Harmonic Generation (SHG)^{10, 12} en zenuwvezels door Derde Harmonische Generatie (THG)^11,13. Ten slotte heeft een verbetering in de technieken om de bewegingsartefacten als gevolg van hartslag en ademhaling te minimaliseren geleid tot de ontwikkeling van intravitale subcellulaire microscopie (ISMic), waardoor onderzoekers verschillende subcellulaire gebeurtenissen rechtstreeks bij levende dieren kunnen afbeelden en onderzoeken met een resolutieniveau dat vergelijkbaar is met die welke in vitro zijn waargenomen 14,15,16,17 . Voorbeelden van ISMic zijn onder meer het onderzoeken van de dynamiek van het cytoskelet tijdens exocytose 14,15,16,17 en endocytose ¹⁵, dynamische remodellering van het cytoskelet tijdens celmigratie^17,18, mitochondriale lokalisatie en metabolisme^19,20 en calciumsignalering in de hersenen 21.

Dit protocol beschrijft de verschillende stappen en procedures om de remodellering van het celmembraan met een subcellulaire resolutie te onderzoeken tijdens de migratie van neutrofielen in de oorhuid van een levende muis met behulp van ISMic. Deze aanpak is gebaseerd op eerder beschreven protocollen^22,23 en aangepast om een hogere ruimtelijke en temporele resolutie te bereiken.

Protocol

Alle dierproeven en -procedures zijn goedgekeurd door het National Cancer Institute (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA) Animal Care and Use Committee (protocollen LCMB-031 en LCMB-035) en voldeden aan alle relevante ethische voorschriften. Zowel mannelijke als vrouwelijke muizen tussen de 2 en 6 maanden oud werden gebruikt voor de experimenten. mT/mG – en wild-type (WT) gastheermuizen hebben een FVB/ NJ-achtergrond, terwijl LyzM-Cre x mTmG-muizen een C57BL/6-achtergrond hebben. 1. Materialen en bereiding van reagentia en gereedschappen Smeer tubes, schaaltjes en naalden/spuiten ‘s nachts in met PBS + 1% BSA (zonder calcium en magnesium) onder agitatie. Reinig oppervlakken en gereedschappen/instrumenten die voor dierwerk worden gebruikt zorgvuldig met 70% ethanol of door middel van autoclaveren.Bereid voor de zuivering van neutrofielen het volgende voor: 3 x 15 ml buizen, 1 x 60 mm schaal, 1 x 1,5 ml buis; HBSS met 10 mM HEPES (pH 7,3); lyse-oplossing voor rode bloedcellen (ACK); Histopaque 1077; en Histopaque 1119. Bereid voor injecties met neutrofielen het volgende voor: 1 x spuit met een laag volume (10 μl), 1 x 33 G afgeschuinde naald, isofluraan en anesthesieoplossing (ketamine, xylazine en acepromazine in respectievelijk 80 mg·kg-1, 2 mg·kg-1 en 4 mg·kg-1 in zoutoplossing). 2. Zuivering van neutrofielen van een donormuis Euthanaseer de donormuis volgens de lokale institutionele voorschriften. Verzamel lange botten van het dier (dijbeen, scheenbeen en opperarmbeen), let op het behoud van de botintegriteit en vermijd het snijden in de koppen van de botten tijdens het verzamelen24. Verwijder spieren en vetweefsel in een schaal van 60 mm met BSA-coating. Snijd de koppen van de botten door om toegang te krijgen tot het merg en spoel en homogeniseer het beenmerg vervolgens met behulp van een spuit (naald van 27 G) gevuld met HBSS. Filtreer de oplossing in een 15 ml BSA-gecoate buis met behulp van een zeef van 40 μm en centrifugeer deze gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT) op 400 x g . Aspireer het supernatant op, resuspendeer de pellet gedurende 30 s in 1 ml ACK om de rode bloedcellen te lyseren en voeg vervolgens 9 ml HBSS toe om de lysis te stoppen. Centrifugeer de oplossing bij 400 x g gedurende 5 minuten bij RT. Bereid een dichtheidsstapgradiënt voor in een 15 ml BSA-gecoate buis door voorzichtig 4 ml 1119 Histopaque op de bodem van de tube te plaatsen en vervolgens voorzichtig 4 ml 1077 Histopaque op de bovenkant aan te brengen. Wees extra voorzichtig om te voorkomen dat de twee lagen worden vermengd. Zuig het supernatans op en resuspendeer de celpellet in 2 ml HBSS. Leg de oplossing voorzichtig op de hierboven voorbereide stapgradiënt. Centrifugeer gedurende 30 minuten met 1.000 x g bij RT met de laagst mogelijke acceleratie- en vertragingssnelheid (“geen rem” heeft de voorkeur). Zuig vanaf de bovenkant van de buis voorzichtig de helft van de 1077 Histopaque-laag op. Verzamel de resterende helft van de 1077 Histopaque-laag en de bovenste helft van de 1119 Histopaque-laag in een verse BSA-gecoate buis. De troebele celsuspensie tussen de twee dichtheidslagen bevat voornamelijk neutrofielen. Voeg HBSS toe om een eindvolume van 15 ml te bereiken en meng voorzichtig door de buis om te keren. Centrifugeer op 400 x g gedurende 5 minuten bij RT. Na het centrifugeren de celpellet resuspenderen en wassen met 10 ml HBSS en 5 minuten centrifugeren op 400 x g bij kamertemperatuur. Herhaal de procedure en suspendeer de pellet vervolgens opnieuw in 15 ml HBSS om het aantal cellen te bepalen met behulp van een cellenteller. Draai en resuspendeer ten slotte de cellen in 1 ml HBSS en breng ze over naar een 1,5 ml BSA-gecoate buis. Bewaar na zuivering de neutrofielensuspensie in de BSA-gecoate buis gedurende 30 minuten onder zachte beweging op een buisrotator bij RT tot etikettering en/of injectie.OPMERKING: Een succesvolle zuivering levert 10-20 x 106 neutrofielen per muis op met een zuiverheid van 95%. De zuiverheid wordt beoordeeld via flowcytometrie, met behulp van eerder beschreven neutrofiele markers (Ly6G+, Ly6C-, Gr1+ en CD11b+)25,26.OPMERKING: Protocollen voor de zuivering van neutrofielen uit menselijk perifeer bloed en beenmerg van muizen zijn eerder beschikbaar24,27. 3. Etikettering van neutrofielen OPMERKING: Om de neutrofielen te visualiseren, werden ze gezuiverd uit LyzM-Cre mT/mG-muizen, waarin myeloïde cellen een membraangericht peptide tot expressie brengen dat is versmolten met de GFP. Bovendien werden gezuiverde neutrofielen van wildtype (WT) muizen in vitro geëtiketteerd. De volgende stappen beschrijven de procedure die wordt gebruikt om gezuiverde neutrofielen te labelen met een in de handel verkrijgbare celdoorlatende groene fluorescerende kleurstof en kan worden aangepast aan elke andere MPM-compatibele fluorescerende sonde naar keuze. Voeg de groene fluorescerende kleurstof (door de fabrikant aanbevolen concentratie; hier 1 μM) toe aan de neutrofiele suspensie (gezuiverd uit WT-muis) in een 1,5 ml BSA-gecoate buis. Incubeer gedurende 30 minuten bij RT onder zachte beweging in een buisrotator. Was driemaal met HBSS, centrifugeer op 400 x g gedurende 5 minuten bij RT en resuspendeer de pellet in 1 ml HBSS. Houd de neutrofielensuspensie in de BSA-gecoate buis onder zachte beweging in een buisrotator bij RT tot de injectieprocedure.OPMERKING: Injectie van gelabelde neutrofielen direct na het labelen heeft sterk de voorkeur. Indien nodig kunnen gelabelde neutrofielen echter nog 10-15 minuten na het labelen onder agitatie worden gehouden zonder de integriteit van de neutrofielenrespons in vivo in gevaar te brengen. Langdurige agitatie (meer dan 60 minuten na het labelen) zal leiden tot klonteren, neutrofielendood en misleidende waarnemingen in vivo. Resuspendeer de celpellet vlak voor de injectie in een zoutoplossing om een dichtheid van 2-5 x 106 cellen per 20 μL te bereiken. 4. Injectie met neutrofielen OPMERKING: Anesthesie moet worden uitgevoerd volgens de richtlijnen van de lokale institutionele Animal Care and Use Committee. Plaats het dier in een gesloten kamer en dien 3%-5% isofluraan (debiet van 2 l/min) toe met behulp van een gekalibreerde verdamper die is aangesloten op een zuurstofconcentrator. Beoordeel of het dier bewusteloos is door de terugtrekkingsreflex van de poten te testen bij het knijpen van de achtervoetzool. Breng het dier vervolgens over naar een verwarmingskussen (37° C) om zijn lichaamstemperatuur op peil te houden. Ga door met het toedienen van de isofluraan (1%-2%; debiet van 0,5 l/min) via een neuskegel.VEILIGHEIDSOPMERKING: Om de blootstelling van het personeel aan toxische isofluraan te beperken, wordt het gebruik van een dispensersysteem dat is uitgerust met een filtereenheid om circulerend isofluraan op te vangen, aanbevolen. Om de beeldkwaliteit te optimaliseren, verwijdert u de haartjes uit het oor met een fijne trimmer. Deze procedure kan ook een dag of twee voor het experiment worden uitgevoerd.OPMERKING: Het gebruik van ontharingscrème wordt afgeraden, omdat bekend is dat het de ontstekingsreactie in de muizenhuid verergert en beeldvormingsartefacten introduceert. Leg het dier op zijn zij. Houd met chirurgische tape de rand van het oor vast en druk deze plat langs het verwarmingskussen. Breng de tape voorzichtig aan om schade aan het oor te voorkomen. Vul een spuit uitgerust met een naald van 33 G met de neutrofielensuspensie (2-5 x 10,6 cellen per 20 μL) en monteer deze op een micromanipulator.OPMERKING: De injectiehoek tussen de naald en het oor op een verwarmingskussen moet tussen 10° en 30° zijn om weefselbeschadiging tot een minimum te beperken en het succes van de celinjectie te vergroten. Beweeg de naald voorzichtig (met de schuine kant omhoog) in de richting van het oor en doorboor langzaam de huid. Zodra de naald in de huid zit, duwt u langzaam op de zuiger en levert u 2-3 μL celsuspensie.OPMERKING: Gebieden met zichtbare bloedvaten moeten worden vermeden, omdat beschadiging van een bloedvat leidt tot een ongewenste en complexe immuunrespons op injectie en problemen met de beeldvorming. Herhaal de injectie in 2-3 verschillende delen van het oor, bij voorkeur 2-3 mm uit elkaar. “Overvul” het oor niet met de celsuspensie.OPMERKING: De injectie moet in het midden van het oor worden uitgevoerd. De omtrek van het oor is dun en moet met zorg worden behandeld, omdat het gemakkelijk kan worden beschadigd, terwijl het middelste deel dikker is met grotere bloedvaten en minder haarzakjes, en bestand is tegen grotere injectievolumes. Verwijder voorzichtig de operatietape en laat het dier onder toezicht weer bij bewustzijn komen. Laat het dier 1 uur rusten voordat u beeldvorming maakt om het weefsel en de cellen te laten herstellen van de injectieprocedure. 5. Anesthesie voor IVM OPMERKING: Een diepere anesthesie verbetert de beeldvormingskwaliteit aanzienlijk door de bewegingsartefacten als gevolg van hartslag en ademhaling te verminderen. Met neutrofielen geïnjecteerde muizen worden onderworpen aan chemische anesthesie, wat een diepere sedatie biedt dan door gas geïnduceerde anesthesie. Anesthesie moet worden uitgevoerd volgens de richtlijnen van de plaatselijke institutionele commissie voor dierenverzorging en -gebruik. Een uur na herstel van de injectie met neutrofielen verdooft u de dieren door middel van een subcutane injectie met een mengsel van xylazine/ketamine/acepromazine (respectievelijk 80 mg kg-1, 2 mg kg-1 en 4 mg kg-1) in een zoutoplossing.OPMERKING: Om de reproduceerbaarheid en betrouwbaarheid van de resultaten te garanderen, moeten de dieren vanaf het moment van anesthesie tot het einde van het experiment warm worden gehouden met behulp van een verwarmingskussen of een watercirculatiekussen dat is aangesloten op een verwarmingspomp. Om de anesthesie langer dan 1 uur te behouden, injecteert u elke 40 minuten subcutaan een mengsel van ketamine/acepromazine (respectievelijk 40 mg·kg-1 en 2 mg·kg-1 ). Controleer verdoofde muizen regelmatig op tekenen van bewustzijn door de pootterugtrekkingsreflex te testen. Breng bovendien voor beeldvormingsprocedures die langer dan 1 uur duren een steriele, niet-medicamenteuze oogzalf aan op de ogen om uitdroging van het hoornvlies tijdens anesthesie te voorkomen en de hydratatie van het lichaam te behouden door subcutane injecties met een zoutoplossing (200 μL per uur).OPMERKING: Als alternatief kan een digitaal gestuurd op perfusie gebaseerd systeem worden gebruikt om een periodieke en soepele injectie van de anesthesieoplossing te garanderen en/of vloeistoffen toe te dienen. Een geautomatiseerde spuitdriver kan worden ingesteld om het gewenste verdovingsvolume toe te dienen en gedurende langere perioden hydratatie te bieden. Daartoe kan een gevleugelde infuusnaald subcutaan in de dorsale huid van het dier worden ingebracht en met chirurgische tape worden vastgezet. 6. Beeldvorming OPMERKING: De opstelling van het dier en de hier beschreven beeldvormingsparameters zijn geoptimaliseerd voor een omgekeerde multifotonenmicroscoop die is uitgerust met een enkele laserlijn om emissies van de verschillende fluoroforen te exciteren en tegelijkertijd te verzamelen. Voordat u het verdoofde dier op de microscooptafel plaatst, moet u ervoor zorgen dat de microscoop is ingeschakeld en dat zowel de tafel als de lenzen zijn voorverwarmd tot 37 °C. Bedek het gat op het podium met een glazen dekglaasje (dikte #1 of 1,5) dat is uitgelijnd met de verwarmde lens. Verplaats het dier voorzichtig naar het podium. Als beeldvorming voor een lange duur (>1 uur) is gepland, breng dan oogheelkundige zalf aan en zet het op gevleugelde infusie gebaseerde perfusiesysteem vast zoals hierboven beschreven. Plaats een druppel zoutoplossing op het midden van het dekglaasje en plaats het met neutrofielen geïnjecteerde oor erop. Druk het oor voorzichtig plat met een steriel wattenstaafje over het midden van het dekglaasje om luchtbellen te verwijderen.OPMERKING: Het aanbrengen van zoutoplossing (of PBS) tussen het oor en het dekglaasje vermindert de lichtbreking als gevolg van luchtbellen, waardoor een gelijkmatige brekingsindex en een superieure beeldkwaliteit worden gegarandeerd. Zet het oor vast door een houten stokje (verwijderd van het wattenstaafje) voorzichtig tegen de zijkant van het oor dichter bij de kop van het dier te drukken en deze vast te zetten met tape (Figuur 1A).OPMERKING: Een beveiligde houten stok minimaliseert bewegingsartefacten als gevolg van hartslag en ademhaling en verhoogt de beeldkwaliteit drastisch. Belangrijk is dat de houten stok net genoeg moet worden vastgemaakt om het oor te stabiliseren zonder de bloedstroom te belemmeren. Zoek met behulp van het microscoopoculair een interessegebied en schakel vervolgens over naar de multifotonacquisitiemodus. Stel de golflengte van de laserexcitatie in op 900-930 nm om gelijktijdige verwerving van GFP/groene fluorescerende kleurstof, mTomato en collageen-I (via SHG) mogelijk te maken. Stel de juiste set spiegels en filtercombinatie in op de detectoren om het uitgestraalde licht op te vangen (banddoorlaatfilters: blauw = 410-460 nm, groen = 495-540 nm, rood = 580-640 nm).OPMERKING: Geïnjecteerde neutrofielen vertonen, wanneer ze zijn gelabeld met een groen-fluorescerende kleurstof, een sterke groene fluorescentie, waardoor ze zichtbaar zijn onder het microscoopoculair, zelfs als ze in diepere delen van het oor worden geïnjecteerd. Bepaal de instelling die het meest geschikt is voor de hardwareconfiguratie. Zelfs als migrerende cellen kunnen worden gevolgd met een interval van 30 s tot 1 minuut, beeldt subcellulaire gebeurtenissen met een hogere snelheid (ten minste <10 s interval). In het onderstaande voorbeeld worden twee verschillende beeldvormingsopstellingen gepresenteerd om het verschil tussen klassieke IVM en ISMic te laten zien.In de klassieke IVM-benadering om celmigratie te volgen en het weefsel van de gastheermuis te onderzoeken (Figuur 1), gebruikt u een 30x-lens en een galvoscanner met een beeldgrootte van 512 x 512 pixels (pixelgrootte van 0,83 μm) en stelt u de verplaatsing van de z-as in met behulp van de gemotoriseerde tafel met een stapgrootte van 2 μm, waardoor elke 30 s een beeld van een diep volume van 30 μm kan worden gemaakt. In de ISMische benadering van zeer dynamische membraanremodellering van afbeeldingen bij een hogere vergroting en resolutie (Figuur 2), gebruikt u een 40x-lens en een resonantiescanner met 3x gemiddelde en een beeldgrootte van 512 x 512 pixels (pixelgrootte van 0,25 μm) en stelt u de z-asverplaatsing in met behulp van een piëzo met een stapgrootte van 1 μm, Waardoor elke 4-5 s een beeldvorming van een diep volume van 20 μm mogelijk is. Activeer de migratie van neutrofielen door een steriel laserletsel te induceren. Richt de excitatielaser met een hoog vermogen dat voldoende is om ten minste 80 mW22 te bereiken, op een smal gebied van het weefsel (20 μm x 20 μm) gedurende 10 s. Identificeer de door laser veroorzaakte verwonding aan de hand van de sterke autofluorescerende signalen die in alle kanalen verschijnen en aan de resulterende verandering van de collageenrangschikking (Figuur 1D).OPMERKING: Om betrouwbare resultaten te verkrijgen, moet het letsel altijd zo ver mogelijk van de bloedvaten worden veroorzaakt; Als ze worden gescheurd, zullen bloedcellen die in het weefsel vrijkomen, de beeldvormingskwaliteit beïnvloeden en resulteren in een sterke algehele immuunreactie. Bewaar de gegevens aan het einde van het experiment voor verdere analyses. Euthanaseer het dier volgens de lokale institutionele richtlijnen. Indien nodig kan weefsel worden verzameld voor fixatie en verdere verwerking. 7. Representatieve data-analyse OPMERKING: Gegevens kunnen worden gevisualiseerd en geanalyseerd met de microscoopsoftware, software van derden of aangepaste programma’s. De procedure en de gebruikte instrumenten zijn afhankelijk van de specifieke behoeften van de onderzoekers. Hier is een voorbeeld te zien van een workflow om membraankromming en lokale gebiedsveranderingen aan de voorrand en de achterkant van de migrerende neutrofielen te kwantificeren. Open de beeldvormingsbestanden met Imaris of Fiji om de migratie van de neutrofielen in 4D te visualiseren en de kwaliteit van het experiment te bepalen.OPMERKING: Imaris en Fiji kunnen het beeldvormingsformaat van verschillende microscoopmerken lezen. Verwerk de gegevens met de volgende stappen door aangepaste MATLAB-codescripts uit te voeren. Lees de geselecteerde beeldbestanden met het Bio-Formats28-pakket voor MATLAB. Segmenteer elk frame van het 3D-volume met het Otsu-algoritme29 om de afzonderlijke cellen te identificeren. Volg de geïdentificeerde objecten op basis van het minimale verplaatsingscriterium30. Bepaal de actieve contouren en grenzen van het object.Genereer een max-projectie voor elk object dat in een tijdsbestek is geïdentificeerd. Pas de bwboundaries-functie in MATLAB toe op de maximale projectie van elk geïdentificeerd object uit stap 7.2 om 100 grenspunten te genereren. Optimaliseer de grenspunten die zijn geïdentificeerd met het dynamische contouralgoritme om subpixelprecisie31 (Figuur 3A) te bereiken met behulp van de functies in het MATLAB-pakket dat is gedownload via http://www.iacl.ece.jhu.edu/static/gvf/. Leg de grenzen voor het object en de objectbaanindex die is bepaald door de tracking in stap 7.3 over de maximale projectie van de originele afbeelding om een uitvoer van een 2D-overlay-film te genereren voor visualisatie en handmatige controle. Selecteer in de overlappende film handmatig alle objecten die zijn geïdentificeerd als migrerende cellen door niet-celobjecten, aanraakobjecten en objecten met onvolledige grenzen uit te sluiten. Noteer de volgindices, start- en eindframes van elke celbaan in een spreadsheet die kan worden gebruikt als invoer voor de volgende stappen die zijn geïmplementeerd door MATLAB-codescripts. Volg de celgrenspunten van elk frame naar het volgende frame volgens het minimale verplaatsingscriterium. Gebruik de functie Polyarea in MATLAB om de oppervlakte te berekenen die wordt onderstreept door aangrenzende grenspunten in twee opeenvolgende tijdsbestekken (Figuur 3C). Als de lokale celgrens vanuit de cel naar buiten beweegt, wijst u een positief teken toe aan de gebiedsverandering. Als de lokale celgrens naar binnen beweegt naar de cel, wijst u een minteken toe aan de gebiedsverandering. Meet de lokale membraankromming op elk grenspunt voor elk frame door de aangrenzende grenspunten op een cirkel te passen (5 per zijde; totaal 11)32 (Figuur 3B). Genereer kymografen met behulp van de imagesc-functie in MATLAB (figuren 3D,E) om de veranderingen van de subcellulaire kenmerken in de loop van de tijd weer te geven en betrekking te hebben op de positie van de cel.

Representative Results

Hier worden twee verschillende reeksen resultaten gepresenteerd om klassieke IVM en ISMic te illustreren die respectievelijk cellulaire en subcellulaire resolutie bieden. In het eerste voorbeeld werden neutrofielen gezuiverd uit een wildtype (WT) muis, gelabeld met Cell Tracker Green om het cytoplasma te kleuren, en geïnjecteerd in een transgene muis die een fluorescerend eiwit tot expressie bracht dat gericht was op het plasmamembraan (mTomato-muis, ook bekend als mT/mG33, Figuur 1 en Movie 1 en Movie 2). Deze ontvangende muis maakte de visualisatie mogelijk van structurele kenmerken in het oorweefsel, zoals bloedvaten, residente cellen en haarzakjes (Figuur 1C en Movie 1) via een op IVM gebaseerde benadering (stap 6.8.1). Collageenvezels, onthuld via SHG (gedetecteerd op de helft van de golflengte van de excitatie), werden gerangschikt in een ingewikkeld netwerk in de dermis, waar neutrofielen werden geïnjecteerd. Langs de rand van de haarzakjes (HF) werd een laag epitheelcellen (d.w.z. keratinocyten) waargenomen. Af en toe werden artefacten van resterende haren die resulteerden in een lokale depressie van de huid gevisualiseerd (H). De door laser geïnduceerde verwondingen waren gemakkelijk te visualiseren dankzij hun sterke autofluorescentie die in alle kanalen werd gedetecteerd en door de veranderingen in de collageenrangschikking (Figuur 1D). Een completer beeld van de 3D-architectuur van de huid en de lokalisatie van de geïnjecteerde neutrofielen is te zien in film 1, die een Z-stapel van de huid van de buitenste naar de binnenste lagen en een 3D-volumeweergave weergeeft. Time-lapse-beeldvorming toonde de neutrofielen die de oorhuid bemonsterden en interageerden met de ECM en het gastheerweefsel (film 2). Beeldvorming met deze resolutie en het verkrijgen van een Z-stack om de 30 s maakt het mogelijk om celtracking uit te voeren en motiliteitsparameters (d.w.z. snelheid en richting) te meten, maar een nauwkeurige en gedetailleerde analyse van membraanremodellering is een uitdaging bij deze resolutie. In het tweede voorbeeld werd membraanremodellering beoordeeld via de ISMic-benadering (stap 6.8.2) met behulp van mGFP-expressieve neutrofielen gezuiverd uit LyzM-cre mT/mG-muizen en geïnjecteerd in WT-dieren (Figuur 2A, experimenteel stroomschema). Met behulp van het ISMic-protocol (Movie 3 en stilstaande beelden in Figuur 2B) en bij laserletsel wordt dynamische remodellering van het plasmamembraan waargenomen tijdens de migratie en wordt de vorming van membraanuitsteeksels aan de voorrand en de terugtrekking van de achterkant van de cellen duidelijk gevisualiseerd (Figuur 2 en Movie 3). De time-lapse-sequenties die in film 3 worden belicht, onthullen de complexiteit van de interacties met de ECM. Inderdaad, neutrofielen migreerden door de interstitiële ruimte en bewogen zich langs de vezels of in de ruimtes ertussen. Ten slotte werden kwantitatieve aspecten zoals de veranderingen in kromming en de oppervlakteveranderingen aan de voor- en achterkant van de cellen voor elk tijdstip gekwantificeerd. Aan de hand van de in figuur 2B beschreven cel werd de lokale dynamiek van het plasmamembraan geanalyseerd met behulp van een algoritmepijplijn (zie stap 7) op basis van de identificatie van 100 grenspunten onder het celoppervlak (figuur 3A). De veranderingen in de lokale kromming (Figuur 3B) en in het gebied dat wordt onderstreept door plasmamembraanuitsteeksels (Figuur 3C) werden voor elk grenspunt berekend en voor elk tijdsbestek gerapporteerd als kymografen (Figuur 3D,E). Zowel de voor- als de achterkant van de cellen behouden een hogere kromming dan de zijkant van de cellen (Figuur 3D); negatieve gebiedsveranderingen (intrekkingen, blauwe gebieden) zijn duidelijker aan de achterkant van de cellen dan aan de voorrand, waar de positieve gebiedsveranderingen prominenter zijn (uitsteeksels, rode gebieden) (Figuur 3E). Figuur 1: IVM van neutrofielen in de huid van het oor van de muis. (A) Schematische tekening van de opstelling van het oor op de microscooptafel. (B) Experimenteel stroomschema. (C) Representatief beeld van de oorhuid van een mTomato-muis geïnjecteerd met fluorescerend gelabelde neutrofielen, met verschillende projecties. Haarfollikel (HF), Bloedvat (BV), Epidermis (E), Dermis (D), Basaalcellaag (BCL) en Haarartefact (als gevolg van een resthaar aan het huidoppervlak, H). (D) Representatief beeld van de huid van muizen na een steriel laserletsel: blauw kanaal (rechts), groen en rood kanaal (midden), samengevoegd beeld (links). Aan de linkerkant van het beeld is schade zichtbaar door een sterke autofluorescentie-emissie in zowel groene als rode kanalen, evenals een verstoring van de ECM waargenomen door de vorming van een gat in de collageen-I-vezels. In C en D, Groen: neutrofielen; Rood: gastheerweefsel van muizen; Cyaan: Collageen-I SHG. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 2: Time-lapse van mGFP-neutrofielen die migreren in een WT-muisoor. (A) Experimenteel stroomschema. (B) Representatieve stilstaande beelden uit film 3. (C) Volumeweergave van dezelfde cel om de 3D-organisatie van het membraan te visualiseren. Het gebied van hoge membraandynamica wordt geïllustreerd door een pijl (rood voor retractie en blauw voor uitsteeksel). (D) Close-up en gekantelde visualisatie van het weergegeven celvolume. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 3: Analysepijplijn voor kwantificering van membraandynamica verzameld met behulp van ISMic. (A) Bepaling van de celcontour en herverdeling van grenspunten (100 grenspunten) tussen twee opeenvolgende frames voor mGFP-neutrofielen beschreven in figuur 2B. (B) Gekleurde grenzen vertegenwoordigen de lokale membraankromming die voor elk grenspunt is bepaald. (C) Het lokale gebied verandert tussen twee opeenvolgende frames (huidig: blauw en volgende: rood). De groene gebieden vertegenwoordigen de volgresultaten van de lokale membraanbeweging. Gele pijlen geven de algemene richting van de membraanverplaatsing aan. (D) Grenskromming kymograaf van de cel in de tijd. De verticale as stelt de grenspuntenindices voor, waarbij 1 en 100 de achterkant van de cel vertegenwoordigen, afhankelijk van de migratierichting. (E) Kymograaf die het membraanuitsteeksel (rood) en de membraanretractie (blauw) van de cel in de loop van de tijd weerspiegelt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Filmpje 1: Groen gelabelde neutrofielen gevisualiseerd in een mTomato muisoor met behulp van IVM. Rood: mTomato gastheer muizenweefsel. Cyaan: Collageen-I SHG; Groen: neutrofiel. Klik hier om deze film te downloaden. Film 2: IVM van neutrofielen die migreren in een mTomato muizenoorhuid. Video’s zijn projecties met maximale intensiteit van een beeldstapel die gedurende ͂27 minuten zijn verkregen met een framesnelheid van 5 frames/s. Rood: mTomato gastheer muizenweefsel. Cyaan: Collageen-I SHG; Groen: neutrofiel. Klik hier om deze film te downloaden. Filmpje 3: ISMic van membraanremodellering tijdens neutrofielenmigratie in een WT-muizenoor. Video’s zijn projecties met maximale intensiteit van een beeldstapel die gedurende ͂8 minuten zijn verkregen met een framesnelheid van 10 frames/s. Rood: mTomato gastheer muizenweefsel. Cyaan: Collageen-I SHG; Groen: mGFP neutrofiel; Lichtgroen: gerenderde neutrofiel. Klik hier om deze film te downloaden.

Discussion

Ondanks tientallen jaren van vooruitgang op het gebied van celmigratie en membraanremodellering, hebben zeer weinig studies IVM gebruikt om subcellulaire kenmerken bij levende dieren te visualiseren. De procedures die in dit protocol worden beschreven, bieden een krachtig hulpmiddel om nieuwe inzichten te verkrijgen in de migratie van neutrofielen bij levende dieren en meer specifiek in de remodellering van plasmamembranen tijdens dit proces. Deze benadering maakt het mogelijk om de migratie van neutrofielen onder fysiologische omstandigheden te onderzoeken, rekening houdend met de inherente complexiteit van de micro-omgeving van het weefsel. Het gebruik van MPM maakt inderdaad de visualisatie van meerdere kenmerken in het gastheerweefsel mogelijk door gebruik te maken van een combinatie van muizenstammen die geselecteerde fluorescerende markers tot expressie brengen, exogene weefsellabeling, excitatie van endogene fluorescentie en signalen gegenereerd door SHG of THG^12,13.

Een mogelijk probleem waarmee u bij deze procedure rekening moet houden, is fotoschade. Hoewel MPM over het algemeen veiliger is dan confocale microscopie met betrekking tot fotobleken en fototoxiciteit, moet voorzichtigheid worden betracht bij het afbeelden van levende weefsels³⁴. Fototoxiciteit kan de resultaten drastisch belemmeren door ofwel beeldvormingsartefacten te creëren, variërend van kleine heldere spikkels tot grotere delen van beschadigd weefsel, of door een verscheidenheid aan intracellulaire routes te remmen/stimuleren. Om fototoxiciteit te voorkomen, moet het laservermogen tot een minimum worden beperkt en moeten de juiste controles worden ontworpen om te controleren of de fysiologische omstandigheden worden gehandhaafd (bijv. het meten van de bloedstroom, sondes voor oxidatieve stress)^35,36. Bovendien worden bij deze specifieke procedure, waarbij de huid betrokken is, albinostammen ten zeerste aanbevolen, aangezien de melanine die aanwezig is in donkerharige dieren gevoeliger is voor fototoxiciteit 36,37,38.

Een van de belangrijkste beperkingen van de procedure zijn het gebruikte microscoopsysteem en de aard van neutrofielen. Hoewel het gebruik van MPM de diepte van weefselbeeldvorming aanzienlijk vergroot in vergelijking met andere lichtmicroscopietechnieken (bijv. confocaal, draaiende schijf), is het vermogen om subcellulaire dynamiek in het oor te visualiseren beperkt tot de buitenste lagen van het weefsel (80-100 μm). Dit komt door de intense lichtverstrooiing die wordt geproduceerd door de dikke ECM-laag, waardoor het moeilijk is om migratie in de diepere lagen te onderzoeken. Een andere beperking is het feit dat neutrofielen zeer kortlevend zijn en niet lang genoeg in cultuur kunnen worden gehouden om genbewerkingstechnieken uit te voeren. Dit kan worden overwonnen door muizen te manipuleren om neutrofielen te produceren die specifieke genen missen of geselecteerde mutaties herbergen, wat natuurlijk de onderzoekskosten en duur verhoogt.

De hier beschreven procedures, hoewel ontworpen om de membraandynamiek te onderzoeken, kunnen worden aangepast om elke celbiologische vraag te beantwoorden, niet alleen in neutrofielen, maar ook in andere immuunceltypen en migrerende cellen. De informatie die wordt verzameld door IVM met lage vergroting over cellulair gedrag (bijv. migratiefenotype, celsnelheid en directionaliteit²²) kan worden aangevuld en gecorreleerd met mechanistische informatie die is verkregen via ISMic over herpositionering van organellen, eiwitsecretie, endocytose, nucleaire dynamiek, calciumdynamiek, cytoskeletorganisatie en netose. Het gebruik van farmacologische en/of genetische manipulaties kan de rol van specifieke moleculaire routes in het proces van interesse benadrukken, waardoor dit een unieke en zeer krachtige benadering is.

Materials

1.5 mL tubes	USA Scientific	4036-3204
15 mL tubes	Corning	430766
1 mL syringe	Covidien	8881501400
27 G needle	Kendall	827112
27 G winged infusion set	Terumo	SV*27EL
30x objective	Olympus	UPLSAPO30XS	1.05 NA, silicon oil immersion
40x objective	Olympus	UPLSAPO40XS	1.23 NA, silicon oil immersion
60 mm dishes	Falcon	353002
6 mL syringe	Kendall	8881516937
Acepromazine (10 mg/mL)	Vet one	13985-587-50
ACK lysis buffer	Quality Biological	118-156-101
Balance	AND	EK-1200A
BSA	Sigma Aldrich	A9647
Cell strainer 40 µm	Sigma Aldrich	CLS431750
Fiji	ImageJ	N/A	Image visualization/analysis software
Fluoview Software	Olympus	N/A	Acquisition software
FVB mouse strain	Jackson	N/A	FVB background
Gas Anesthesia system	Patterson veterinary	07-8915712	Link 7 model
Green Cell tracker	Thermo	C2925	Solubilized in cell culture grade DMSO to reach 1 mM concentration (1000x)
Hair removal cream	Nair	N/A
HBSS (w/o Ca2+, Mg2+)	Gibco	14175-095
HEPES 1 M pH 7.3	Quality Biological	118-089-721
Histopaque 1077	Sigma Aldrich	10771-100ML
Histopaque 1991	Sigma Aldrich	11191-100ML
Imaris	Bitplane	N/A	Image visualization/analysis software
Isoflurane	Vet one	13985-528-40
Ketamine (100 mg/mL)	Vet one	13985-584-10
LyzM-cre x mT/mG	generated in the lab	N/A	C57BL/6J background
Manual micromanipulator	WPI	M3301R
MATLAB	MatWorks	N/A	Analysis software
mtomato mouse strain	generated in the lab	N/A	mT/mG, FVB background
Multiphoton laser	Spectra Physics	Insight DS+
Multiphoton Microscope	Olympus	MPE-RS
Nanofil 10 µL syringe	WPI	NANOFIL
Nanofil 33 G needle	WPI	NF33BV-2
Objective heater	Bioptechs	N/A
Objective heater controller	Bioptechs	150803
Ophtalmic ointment	Major	NDC 0904-6488-38
Oxygen concentrator	Caire	VisionAire 5
PBS (w/o Ca2+, Mg2+)	Quality Biological	114-058-131
Saline	Quality Biological	114-055-101
Stage heater	Okolab	N/A
Stage heater controller	Okolab	H401-T
Surgical tape	3M	1538-1	Hypoallergenic
Syringe driver	Harvard Apparatus	PHD Ultra
Warming Pads	Parkland Scientific	A2789B
Warming Pump	Parkland Scientific	TP-700
Xylazine (100 mg/mL)	Vet one	13985-704-10