JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

Murin İnce Bağırsak Epitel Organoidlerinin Doğuştan Lenfoid Hücrelerle Ko-Kültürü

Published: March 23, 2022
doi:
10.3791/63554
, , ,
1Centre for Host-Microbiome Interactions,King’s College London, 2Wellcome Trust Cell Therapies and Regenerative Medicine Ph.D. Programme,King’s College London, 3Present address: Wellcome Trust/Cancer Research UK Gurdon Institute,Cambridge University

Summary

Bu protokol, murin ince bağırsak organoidlerinin oluşturulması, tip-1 doğuştan gelen lenfoid hücrelerin murin ince bağırsak lamina propriasından izole edilmesi ve bağırsak epitel hücreleri ile tip-1 doğuştan gelen lenfoid hücreler arasındaki çift yönlü etkileşimleri incelemek için her iki hücre tipi arasında 3 boyutlu (3D) ortak kültürlerin oluşturulması için ayrıntılı talimatlar sunmaktadır.

Abstract

Organoidlerin bağışıklık hücreleri ile karmaşık ko-kültürleri, mukozal homeostazın hassas dengesini destekleyen çift yönlü etkileşimleri sorgulamak için çok yönlü bir araç sağlar. Bu 3D, çok hücreli sistemler, çok faktörlü hastalıkları ele almak ve dokuda yerleşik doğuştan gelen lenfoid hücreler (ILC’ler) gibi nadir hücre tiplerini incelerken ortaya çıkan teknik zorlukları çözmek için indirgemeci bir model sunar. Bu makalede, ince bağırsak organoidlerini ve ince bağırsak lamina propria’dan türetilmiş yardımcı benzeri tip-1 ILC’leri (ILC1’ler) birleştiren ve diğer ILC veya immün popülasyonlara kolayca genişletilebilen bir murin sistemi anlatılmaktadır. ILC’ler, homeostazı teşvik ettikleri ve hasar veya enfeksiyona hızla yanıt verdikleri mukozada özellikle zenginleştirilmiş dokuda yerleşik bir popülasyondur. ILC’lerle organoid ko-kültürleri, bağırsaktaki yeni epitelyal-immün sinyal modüllerine ışık tutmaya başlamış ve farklı ILC alt kümelerinin bağırsak epitel bariyeri bütünlüğünü ve rejenerasyonunu nasıl etkilediğini ortaya koymuştur. Bu protokol, mukozal homeostaz ve inflamasyon mekanizmaları hakkında yeni bilgiler sağlama potansiyeline sahip epitel ve bağışıklık hücreleri arasındaki karşılıklı etkileşimler hakkında daha fazla araştırma yapılmasını sağlayacaktır.

Introduction

Bağırsak epiteli ve bağırsakta yerleşik bağışıklık sistemi arasındaki iletişim, bağırsak homeostazının korunmasında merkezidir1. Bu etkileşimlerdeki bozulmalar, İnflamatuar Bağırsak Hastalığı (IBD) ve gastrointestinal kanserler dahil olmak üzere hem lokal hem de sistemik hastalıklarla ilişkilidir2. Homeostazın yakın zamanda tanımlanan kritik bir düzenleyicisinin dikkate değer bir örneği, bağırsak bağışıklık manzarasında kilit oyuncular olarak ortaya çıkan doğuştan gelen lenfoid hücrelerin (ILC’ler) çalışmasından kaynaklanmaktadır3. ILC’ler, bağırsak homeostazını düzenleyen ve inflamasyonu büyük ölçüde sitokin aracılı sinyalizasyon yoluyla düzenleyen heterojen doğuştan gelen bir immün hücre grubudur4.

Murin ILC’ler genel olarak transkripsiyon faktörü, reseptör ve sitokin ekspresyon profillerine göre alt tiplere ayrılır5. Sitotoksik Doğal Öldürücü (NK) hücreleri ve yardımcı benzeri tip-1 ILC’leri (ILC1’ler) içeren Tip-1 ILC’ler, sırasıyla T hücrelerinde (T-bet)6 ekspresyonlu transkripsiyon faktörü (eomezodermin) Eomes ve T-box proteininin ekspresyonu ile tanımlanır ve T yardımcı tip-1 (TH1) bağışıklığı ile ilişkili sitokinleri salgılar: interlökin (IL)-12’ye yanıt olarak interferon-γ (IFNγ) ve tümör nekroz faktörü (TNF), IL-15 ve IL-187. Homeostaz sırasında, dokuda yerleşik ILC1’ler, epitel proliferasyonunu ve matris yeniden modellemesini sağlamak için Transforme Edici Büyüme Faktörü β (TGF-β) salgılar8. Tip-2 ILC’ler (ILC2’ler) öncelikle helmint enfeksiyonuna T yardımcı tip-2 (TH2) ile ilişkili sitokinlerin salgılanması yoluyla yanıt verir: IL-4, IL-5 ve IL-13 ve retinoik asitle ilişkili yetim reseptör (ROR) α (ROR-α)9 ve GATA Bağlayıcı Protein 3 (GATA-3)10,11,12 ekspresyonu ile karakterizedir. . Farelerde, bağırsak “enflamatuar” ILC2’ler, epitel tutam-hücresi kaynaklı IL-25 14,15’e yanıt verdikleri Öldürücü hücre lektin benzeri reseptörün (alt aile G üyesi 1, KLRG)13 ekspresyonu ile karakterize edilir. Son olarak, lenfoid doku indükleyici hücreleri ve yardımcı benzeri tip-3 ILC’leri (ILC3’ler) içeren tip-3 ILC’ler, transkripsiyon faktörü ROR-γt16’ya bağımlıdır ve lokal IL-1β ve IL-23 sinyallerine yanıt olarak Granülosit Makrofaj Kolonisi Uyarıcı Faktörü (GM-CSF), IL-17 veya IL-22 salgılayan gruplara ayrılır17. Lenfoid doku indükleyici hücreler Peyer’in yamalarında kümelenir ve gelişim sırasında bu ikincil lenfoid organların gelişimi için çok önemlidir18, ILC3’ler ise erişkin murin ince bağırsak lamina propriasında en bol ILC alt tipidir. ILC3’lü en eski murin intestinal organoid ko-kültür sistemlerinden biri, sitokin IL-22’nin Sinyal Dönüştürücü ve Transkripsiyon Aktivatörü 3 (STAT-3) aracılı Lösin Bakımından Zengin Tekrar İçeren G Protein Eşleşmiş Reseptör 5 (Lgr5) + bağırsak kök hücre proliferasyonu19 üzerindeki etkisini ayırmak için kullanıldı. rejeneratif ILC-epitel etkileşiminin güçlü bir örneği. ILC’ler organlar arasında damga-heterojenlik sergiler 20,21 ve polarize edici sitokinlere yanıt olarak alt kümeler arasında plastisite sergiler22. Bu dokuya özgü izleri ve plastisite farklılıklarını yönlendiren ve IBD23 gibi kronik hastalıklarda hangi rolü oynadıkları, organoid ortak kültürleri kullanılarak ele alınabilecek heyecan verici konular olmaya devam etmektedir.

İntestinal organoidler, intestinal epitel24,25’i incelemek için başarılı ve güvenilir bir model olarak ortaya çıkmıştır. Bunlar, bağırsak epitelyal Lgr5 + kök hücrelerinin veya Wnt Ailesi Üyesi 3A’nın (Wnt3a) endojen bir kaynağı olarak Paneth hücrelerini içeren tüm izole kriptoların kültürlenmesiyle üretilir. Bu 3D yapılar, sentetik hidrojeller26’da veya bazal lamina propria’yı taklit eden biyomalzemelerde, örneğin Termal-çapraz bağlanan Bazal Hücre Dışı Matriks’te (TBEM) korunur ve ayrıca çevredeki nişi, özellikle Epitel Büyüme Faktörünü (EGF), Kemik Morfogenetik Protein (BMP) inhibitörü Noggin’i ve bir Lgr5-ligand ve Wnt-agonisti R-Spondin127’yi taklit eden büyüme faktörleri ile desteklenir. . Bu koşullar altında, organoidler epitelyal apiko-bazal polariteyi korur ve bağırsak epitelinin kript-villus yapısını, organoidin merkezindeki emici ve salgısal hücrelere terminal olarak farklılaşan tomurcuklanan kök hücre kriptleri ile özetler, daha sonra anoikis28 tarafından iç psödölümenin içine dökülür. Her ne kadar bağırsak organoidleri tek başına epitel gelişiminin indirgemeci modelleri ve izolasyondaki dinamikler olarak büyük ölçüde avantajlı olsa da29,30, bu davranışların bağışıklık bölmesi tarafından nasıl düzenlendiğini, etkilendiğini ve hatta bozulduğunu anlamak için muazzam bir gelecek potansiyeline sahiptir.

Aşağıdaki protokolde, murin ince bağırsak organoidleri ve lamina propria türevi ILC1’ler arasında, bu popülasyonun inflamasyonun bağırsak imzalarını beklenmedik bir şekilde nasıl azalttığını ve bunun yerine bu sistemde TGF-β yoluyla epitel proliferasyonunun artmasına katkıda bulunduğunu tanımlamak için kullanılan bir ko-kültür yöntemi tanımlanmıştır8.

Protocol

Tüm deneyler, hayvan kullanımı için ilgili tüm düzenleyici ve kurumsal yönergelere uygun ve uygun olarak tamamlanmalıdır. Aşağıdaki makale ve videoda açıklanan çalışma için etik onay, hayvan kullanımına ilişkin ilgili tüm düzenleyici ve kurumsal kılavuzlara uygun ve uygun olarak alınmıştır. Tüm fareler, eğitimli bireyler tarafından yürütülen standart etik prosedüre göre servikal çıkık ile itlaf edildi. Organ ve doku toplanmasından önce, femoral arterin …

Representative Results

Başarılı bir şekilde tamamlandığında, yeni izole edilmiş kriptler 2-4 gün içinde tomurcuklanan kript yapıları oluşturmalıdır (Şekil 1A). Sağlıklı ve sağlam organoid kültürler aktif olarak büyümelidir ve protokolde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi geçirilebilir ve genişletilebilir. Bu protokol, ince bağırsak ILC1’in RORγtGFP murin transgenik raporlayıcı hattından izolasyonunu açıklar ve bu da canlı ILC1’in FACS…

Discussion

Bu protokol, murin ince bağırsak organoidlerinin oluşturulması, bağırsak ayrışma protokolü sırasında lenfosit kaybını en aza indirgeyerek nadir ILC1’in izole edilmesi ve bu iki bölme arasında ko-kültürlerin oluşturulması yöntemlerini açıklamaktadır. Bu protokol için birçok adım vardır ve bazıları ILC1’lere özgü olsa da, bu yaklaşım diğer bağırsak bağışıklık hücresi tiplerine uygulanabilir ve ko-kültür kurulumları bireysel araştırma sorularına uyacak şekilde modüler olarak…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

E.R., Wellcome Trust’tan doktora bursunu kabul eder (215027 / Z / 18 / Z). G.M.J., Wellcome Trust’tan (203757 / Z / 16 / A) doktora bursunu kabul eder. D.C., NIHR GSTT BRC’den doktora öğrencisi olduğunu kabul eder. J.F.N., Marie Skłodowska-Curie Bursu, Kral Ödülü bursu, RCUK/UKRI Rutherford Fonu bursu (MR/R024812/1) ve Wellcome Trust’tan Bilim Tohum Ödülü (204394/Z/16/Z) kabul eder. Guy’s Hospital’da bulunan BRC akış sitometrisi çekirdek ekibine de teşekkür ederiz. Rorc(γt)-GfpTG C57BL/6 muhabir fareleri, G. Eberl’in (Institut Pasteur, Paris, Fransa) cömert bir hediyesiydi. CD45.1 C57BL/6 fareler T. Lawrence (King’s College London, Londra) ve P. Barral (King’s College London, Londra) tarafından nazikçe verildi.

Materials

Reagents
2-Mercaptoethanol Gibco 21985023
Anti-mouse CD45 (BV510) BioLegend 103137
Anti-mouse NK1.1 (PE) Thermo Fisher Scientific 12-5941-83
B-27 Supplement (50X), serum free Gibco 17504044
CD127 Monoclonal Antibody (APC) Thermo Fisher Scientific 17-1271-82
CD19 Monoclonal Antibody (eFluor 450) Thermo Fisher Scientific 48-0193-82
CD3e Monoclonal Antibody (eFluor 450) Thermo Fisher Scientific 48-0051-82
CD5 Monoclonal Antibody (eFluor 450) Thermo Fisher Scientific 48-0031-82
CHIR99021 Tocris 4423/10
COLLAGENASE D, 500MG Merck 11088866001
Cultrex HA- RSpondin1-Fc HEK293T Cells Cell line was used to harvest conditioned RSpondin1 supernatant, the cell line and Materials Transfer Agreement was provided by the Board of Trustees of the Lelands Stanford Junior University (Calvin Kuo, MD,PhD, Stanford University)
DISPASE II (NEUTRAL PROTEASE, GRADE II) Merck 4942078001
DMEM/F12 (1:1) (1X) Dulbecco's Modified Eagle Medium Nutrient Mixture F-12 (Advanced DMEM/F12) Gibco 11320033
DNASE I, GRADE II Merck 10104159001
Dulbecco's Modified Eagle Medium (1X) Gibco 21969-035
Ethilenediamine Tetraacetate Acid Thermo Fisher Scientific BP2482-100
FC block 2B Scientific BE0307
Fetal Bovine Serum, qualified, hear inactivated Gibco 10500064
GlutaMAX (100X) Gibco 3050-038
Hanks' Balanced Salt Solution (10X) Gibco 14065056
HBSS (1X) Gibco 12549069
HEK-293T- mNoggin-Fc Cells Cell line was used to harvest conditioned Noggin supernatant, cell line acquired through Materials Transfer Agreement with the Hubrecth Institute, Uppsalalaan8, 3584 CT Utrecht, The Netherlands, and is based on the publication by Farin, Van Es, and Clevers Gastroenterology (2012).
HEPES Buffer Solution (1M) Gibco 15630-056
KLRG1 Monoclonal Antibody (PerCP eFluor-710) Thermo Fisher Scientific 46-5893-82
Live/Dead Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation Thermo Fisher Scientific L23105
Ly-6G/Ly-6C Monoclonal Antibody (eFluor 450) Thermo Fisher Scientific 48-5931-82
Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix, Phenol Red-free, LDEV-free Corning 356231
N-2 Supplement (100X) Gibco 17502048
N-acetylcysteine (500mM) Merck A9165
NKp46 Monoclonal Antibody (PE Cyanine7) Thermo Fisher 25-3351-82
PBS (1 X) 7.2 pH Thermo Fisher Scientific 12549079
PBS (10X) Gibco 70013032
Percoll Cytiva 17089101
Recombinant Human EGF, Animal-Free Protein R&D Systems AFL236
Recombinant Human IL-15 GMP Protein, CF R&D Systems 247-GMP
Recombinant Human IL-2 (carrier free) BioLegend 589106
Recombinant Mouse IL-7 (carrier free) R&D Systems 407-ML-005/CF
UltraComp eBeads Thermo Fisher Scientific 01-2222-42
Y-27632 dihydrochloride (ROCK inhibitor) Bio-techne 1254
Plastics
50 mL tube Falcon 10788561
1.5 mL tube Eppendorf 30121023
10 mL pippette StarLab E4860-0010
15 mL tube Falcon 11507411
25 mL pippette StarLab E4860-0025
p10 pippette tips StarLab S1121-3810-C
p1000 pippette tips StarLab I1026-7810
p200 pippette tips StarLab E1011-0921
Standard tissue culture treated 24-well plate Falcon 353047
Equipment
Centrifuge Eppendorf 5810 R
CO2 and temperature controled incubator Eppendorf Galaxy 170 R/S
Flow Assisted Cellular Sorter BD equipment FACS Aria II
Heated shaker Stuart Equipment SI500
Ice box – –
Inverted light microscope Thermo Fisher Scientific EVOS XL Core Imaging System (AMEX1000)
p10 pippette Eppendorf 3124000016
p1000 pippette Eppendorf 3124000063
p200 pippette Eppendorf 3124000032
Pippette gun Eppendorf 4430000018
Wet ice – –
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Martini, E., Krug, S. M., Siegmund, B., Neurath, M. F., Becker, C. Mend your fences. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 4 (1), 33-46 (2017).
  2. Peterson, L. W., Artis, D. Intestinal epithelial cells: regulators of barrier function and immune homeostasis. Nature Reviews Immunology. 14, 141-153 (2014).
  3. Diefenbach, A., Gnafakis, S., Shomrat, O. Innate lymphoid cell-epithelial cell modules sustain intestinal homeostasis. Immunity. 52 (3), 452-463 (2020).
  4. Ebbo, M., Crinier, A., Vély, F., Vivier, E. Innate lymphoid cells: major players in inflammatory diseases. Nature Reviews Immunology. 17 (11), 665-678 (2017).
  5. Vivier, E., et al. Innate lymphoid cells: 10 years on. Cell. 174 (5), 1054-1066 (2018).
  6. Klose, C. S. N., et al. Differentiation of type 1 ILCs from a common progenitor to all helper-like innate lymphoid cell lineages. Cell. 157 (2), 340-356 (2014).
  7. Bernink, J. H., et al. Interleukin-12 and -23 control plasticity of CD127+ group 1 and group 3 innate lymphoid cells in the intestinal lamina propria. Immunity. 43 (1), 146-160 (2015).
  8. Jowett, G. M., et al. ILC1 drive intestinal epithelial and matrix remodelling. Nature Materials. 20 (2), 250-259 (2020).
  9. Wong, S. H., et al. Transcription factor RORα is critical for nuocyte development. Nature Immunology. 13, 229-236 (2012).
  10. Neill, D. R., et al. Nuocytes represent a new innate effector leukocyte that mediates type-2 immunity. Nature. 464, 1367-1370 (2010).
  11. Mjösberg, J., et al. The transcription factor GATA3 is essential for the function of human type 2 innate lymphoid cells. Immunity. 37 (4), 649-659 (2012).
  12. Hoyler, T., et al. The transcription factor GATA-3 controls cell fate and maintenance of type 2 innate lymphoid cells. Immunity. 37 (4), 634-648 (2012).
  13. Huang, Y., et al. IL-25-responsive, lineage-negative KLRG1hi cells are multipotential ‘inflammatory’ type 2 innate lymphoid cells. Nature Immunology. 16, 161-169 (2014).
  14. von Moltke, J., Ji, M., Liang, H. E., Locksley, R. M. Tuft-cell-derived IL-25 regulates an intestinal ILC2-epithelial response circuit. Nature. 529, 221-225 (2016).
  15. Gerbe, F., et al. Intestinal epithelial tuft cells initiate type 2 mucosal immunity to helminth parasites. Nature. 529, 226-230 (2016).
  16. Eberl, G., et al. An essential function for the nuclear receptor RORgamma(t) in the generation of fetal lymphoid tissue inducer cells. Nature Immunology. 5, 64-73 (2004).
  17. Spits, H., et al. Innate lymphoid cells–a proposal for uniform nomenclature. Nature Reviews Immunology. 13, 145-149 (2013).
  18. Mebius, R. E., Rennert, P., Weissman, I. L. Developing lymph nodes collect CD4+CD3- LTbeta+ cells that can differentiate to APC, NK cells, and follicular cells but not T or B cells. Immunity. 7 (4), 493-504 (1997).
  19. Lindemans, C. A., et al. Interleukin-22 promotes intestinal-stem-cell-mediated epithelial regeneration. Nature. 528 (7583), 560-564 (2015).
  20. Meininger, I., et al. Tissue-specific features of innate lymphoid cells. Trends in Immunology. 41 (10), 902-917 (2020).
  21. Dutton, E. E., et al. Characterisation of innate lymphoid cell populations at different sites in mice with defective T cell immunity. Wellcome Open Research. 2, 117 (2018).
  22. Bal, S. M., Golebski, K., Spits, H. Plasticity of innate lymphoid cell subsets. Nature Reviews Immunology. 20, 552-565 (2020).
  23. Bernink, J. H., et al. Human type 1 innate lymphoid cells accumulate in inflamed mucosal tissues. Nature Immunology. 14, 221-229 (2013).
  24. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  25. Ootani, A., et al. Sustained in vitro intestinal epithelial culture within a Wnt-dependent stem cell niche. Nature Medicine. 15 (6), 701-706 (2009).
  26. Gjorevski, N., et al. Designer matrices for intestinal stem cell and organoid culture. Nature. 539 (7630), 560-564 (2016).
  27. Sato, T., Clevers, H. Primary mouse small intestinal epithelial cell cultures. Methods in Molecular Biology. 945, 319-328 (2012).
  28. Date, S., Sato, T. Mini-gut organoids: reconstitution of the stem cell niche. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 31, 269-289 (2015).
  29. Bartfeld, S. Modeling infectious diseases and host-microbe interactions in gastrointestinal organoids. Developmental Biology. 420 (2), 262-270 (2016).
  30. Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
  31. Tallapragada, N. P., et al. Inflation-collapse dynamics drive patterning and morphogenesis in intestinal organoids. Cell Stem Cell. 28 (9), 1516-1532 (2021).
  32. Qiu, Z., Sheridan, B. S. Isolating lymphocytes from the mouse small intestinal immune system. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e57281 (2018).
  33. Sato, T., Clevers, H. Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications. Science. 340 (6137), 1190-1194 (2013).
  34. O’Rourke, K. P., Ackerman, S., Dow, L. E., Lowe, S. W. Isolation, culture, and maintenance of mouse intestinal stem cells. Bio-protocol. 6 (4), 1733 (2016).
  35. Serra, D., et al. Self-organization and symmetry breaking in intestinal organoid development. Nature. 569 (7754), 66-72 (2019).
  36. Lukonin, I., et al. Phenotypic landscape of intestinal organoid regeneration. Nature. 586 (7828), 275-280 (2020).
  37. Cardoso, V., et al. Neuronal regulation of type 2 innate lymphoid cells via neuromedin U. Nature. 549 (7671), 277-281 (2017).
  38. Gury-BenAri, M., et al. The spectrum and regulatory landscape of intestinal innate lymphoid cells are shaped by the microbiome. Cell. 166 (5), 1231-1246 (2016).
  39. Seehus, C., Kaye, J. In vitro differentiation of murine innate lymphoid cells from common lymphoid progenitor cells. Bio-protocol. 6 (6), 1770 (2016).

Tags

Co-cultureMurineSmall IntestineEpithelial OrganoidsInnate Lymphoid CellsIn Vitro ModelIntestinal HomeostasisInflammationILC1CD44Gastrointestinal DiseasesThermal Cross-linkingBasal Extracellular MatrixAdvanced DMEM F12PBS2Centrifugation

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Read, E., Jowett, G. M., Coman, D., Neves, J. F. Co-Culture of Murine Small Intestine Epithelial Organoids with Innate Lymphoid Cells. J. Vis. Exp. (181), e63554, doi:10.3791/63554 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image