Summary

Cocultivo de organoides epiteliales del intestino delgado murino con células linfoides innatas

Published: March 23, 2022
doi:

Summary

Este protocolo ofrece instrucciones detalladas para establecer organoides murinos del intestino delgado, aislar las células linfoides innatas tipo 1 de la lámina propia del intestino delgado murino y establecer cocultivos tridimensionales (3D) entre ambos tipos de células para estudiar las interacciones bidireccionales entre las células epiteliales intestinales y las células linfoides innatas tipo 1.

Abstract

Los cocultivos complejos de organoides con células inmunes proporcionan una herramienta versátil para interrogar las interacciones bidireccionales que sustentan el delicado equilibrio de la homeostasis de la mucosa. Estos sistemas multicelulares en 3D ofrecen un modelo reduccionista para abordar las enfermedades multifactoriales y resolver las dificultades técnicas que surgen al estudiar tipos de células raras, como las células linfoides innatas residentes en los tejidos (ILC). Este artículo describe un sistema murino que combina organoides del intestino delgado y láminas del intestino delgado derivadas de ILC tipo 1 (ILC1), que se pueden extender fácilmente a otras poblaciones de ILC o inmunes. Las ILC son una población residente en el tejido que está particularmente enriquecida en la mucosa, donde promueven la homeostasis y responden rápidamente al daño o la infección. Los cocultivos organoides con ILC ya han comenzado a arrojar luz sobre nuevos módulos de señalización epitelial-inmune en el intestino, revelando cómo los diferentes subconjuntos de ILC afectan la integridad y la regeneración de la barrera epitelial intestinal. Este protocolo permitirá nuevas investigaciones sobre las interacciones recíprocas entre las células epiteliales e inmunes, que tienen el potencial de proporcionar nuevos conocimientos sobre los mecanismos de la homeostasis y la inflamación de la mucosa.

Introduction

La comunicación entre el epitelio intestinal y el sistema inmunitario residente en el intestino es fundamental para el mantenimiento de la homeostasis intestinal1. Las interrupciones de estas interacciones se asocian con enfermedades locales y sistémicas, incluida la enfermedad inflamatoria intestinal (EII) y los cánceres gastrointestinales2. Un ejemplo notable de un regulador crítico de la homeostasis descrito más recientemente proviene del estudio de las células linfoides innatas (ILC), que han surgido como actores clave en el panorama inmunológico intestinal3. Las ILC son un grupo de células inmunes innatas heterogéneas que regulan la homeostasis intestinal y orquestan la inflamación en gran medida a través de la señalización mediada por citoquinas4.

Las ILC murinas se dividen ampliamente en subtipos basados en los perfiles de expresión de factores de transcripción, receptores y citoquinas5. Las ILC de tipo 1, que incluyen células asesinas naturales (NK) citotóxicas y ILC tipo 1 similares a las auxiliares (ILC1), se definen por la expresión del factor de transcripción (eomesodermina) Eomes y la proteína T-box expresadas en células T (T-bet)6, respectivamente, y secretan citoquinas asociadas con la inmunidad T helper tipo 1 (TH1): interferón-γ (IFNγ) y factor de necrosis tumoral (TNF), en respuesta a la interleucina (IL)-12, IL-15 e IL-187. Durante la homeostasis, los ILC1 residentes en el tejido secretan factor de crecimiento transformador β (TGF-β) para impulsar la proliferación epitelial y la remodelación de la matriz8. Las ILC tipo 2 (ILC2) responden principalmente a la infección por helmintos a través de la secreción de citoquinas asociadas al T ayudante tipo 2 (TH2): IL-4, IL-5 e IL-13, y se caracterizan por la expresión del receptor huérfano relacionado con el ácido retinoico (ROR) α (ROR-α)9 y la proteína de unión a GATA 3 (GATA-3)10,11,12 . En ratones, las ILC2 “inflamatorias” intestinales se caracterizan además por la expresión del receptor similar a la lectina de células asesinas (miembro G de la subfamilia G 1, KLRG)13 donde responden a il-25 derivada de células epiteliales del mechón14,15. Finalmente, las ILC tipo 3, que incluyen células inductoras de tejido linfoide y ILC tipo 3 similares a ayudantes (ILC3), dependen del factor de transcripción ROR-γt16 y se agrupan en grupos que secretan factor estimulante de colonias de macrófagos granulocitos (GM-CSF), IL-17 o IL-22 en respuesta a las señales locales de IL-1β e IL-2317. Las células inductoras de tejido linfoide se agrupan en los parches de Peyer y son cruciales para el desarrollo de estos órganos linfoides secundarios durante el desarrollo18, mientras que las ILC3 son el subtipo de ILC más abundante en la lámina propia del intestino delgado murino adulto. Uno de los primeros sistemas de cocultivo de organoides intestinales murinos con ILC3 se aprovechó para separar el impacto de la citoquina IL-22 en el transductor de señal y activador de la transcripción 3 (STAT-3) mediado por la repetición rica en leucina que contiene el receptor acoplado a proteína G 5 (Lgr5) + proliferación de células madre intestinales19, un poderoso ejemplo de una interacción regenerativa ILC-epitelial. Las ILC exhiben impronta-heterogeneidad entre órganos20,21 y exhiben plasticidad entre subconjuntos en respuesta a citoquinas polarizantes22. Lo que impulsa estas huellas específicas de los tejidos y las diferencias de plasticidad, y qué papel desempeñan en enfermedades crónicas como la EII23, siguen siendo temas emocionantes que podrían abordarse utilizando cocultivos organoides.

Los organoides intestinales han surgido como un modelo exitoso y fiable para estudiar el epitelio intestinal24,25. Estos se generan mediante el cultivo de células madre epiteliales intestinales Lgr5 +, o criptas aisladas completas, que incluyen células de Paneth como una fuente endógena de Wnt Family Member 3A (Wnt3a). Estas estructuras 3D se mantienen en hidrogeles sintéticos26 o en biomateriales que imitan la lámina basal propia, por ejemplo, la matriz extracelular basal de reticulación térmica (TBEM), y se complementan con factores de crecimiento que imitan el nicho circundante, especialmente el factor de crecimiento epitelial (EGF), el inhibidor de la proteína morfogenética ósea (BMP) Noggin, y un ligando Lgr5 y un agonista Wnt R-Spondin127 . Bajo estas condiciones, los organoides mantienen la polaridad epitelial apico-basal y recapitulan la estructura cripta-vellosidad del epitelio intestinal con criptas de células madre en ciernes que se diferencian terminalmente en células absorbentes y secretoras en el centro del organoide, que luego se desprenden en el pseudoplume interno por anoikis28. Aunque los organoides intestinales por sí solos han sido enormemente ventajosos como modelos reduccionistas del desarrollo epitelial y la dinámica en aislamiento29,30, tienen un tremendo potencial futuro para comprender cómo estos comportamientos son regulados, influenciados o incluso interrumpidos por el compartimiento inmune.

En el siguiente protocolo se describe un método de cocultivo entre organoides del intestino delgado murino y lámina propia derivada de ILC1s, que se utilizó recientemente para identificar cómo esta población disminuye inesperadamente las firmas intestinales de inflamación y en su lugar contribuye a aumentar la proliferación epitelial a través de TGF-β en este sistema8.

Protocol

Todos los experimentos deben completarse de acuerdo y de conformidad con todas las directrices reglamentarias e institucionales pertinentes para el uso de animales. La aprobación ética para el estudio descrito en el siguiente artículo y video se adquirió de acuerdo y cumplimiento con todas las pautas regulatorias e institucionales relevantes para el uso de animales. Todos los ratones fueron sacrificados por luxación cervical de acuerdo con el procedimiento ético estándar, realizado por …

Representative Results

Cuando se completan con éxito, las criptas recién aisladas deben formar estructuras de cripta en ciernes dentro de 2-4 días (Figura 1A). Los cultivos organoides sanos y robustos deben estar creciendo activamente y pueden pasarse y expandirse como se detalla en el protocolo. Este protocolo describe el aislamiento de ILC1 del intestino delgado de la línea reportera transgénica murina RORγtGFP , lo que permite el aislamiento de ILC1 vivo por FACS (<s…

Discussion

Este protocolo describe los métodos para establecer organoides murinos del intestino delgado, aislar ILC1 raro minimizando la pérdida de linfocitos durante el protocolo de disociación intestinal y establecer cocultivos entre estos dos compartimentos. Hay muchos pasos para este protocolo, y aunque algunos son específicos de las ILC1, este enfoque se puede aplicar a otros tipos de células inmunes intestinales, y las configuraciones de cocultivo se pueden adaptar modularmente para adaptarse a preguntas de investigació…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

E.R. reconoce una beca de doctorado del Wellcome Trust (215027/Z/18/Z). G.M.J. reconoce una beca de doctorado del Wellcome Trust (203757/Z/16/A). D.C. reconoce una beca de doctorado del NIHR GSTT BRC. J.F.N. reconoce una beca Marie Skłodowska-Curie, una beca del Premio del Rey, una beca del Fondo RCUK/UKRI Rutherford (MR/R024812/1) y un Premio Semilla en Ciencia del Wellcome Trust (204394/Z/16/Z). También agradecemos al equipo central de citometría de flujo BRC con sede en Guy’s Hospital. Los ratones reporteros Rorc(γt)-GfpTG C57BL/6 fueron un generoso regalo de G. Eberl (Institut Pasteur, París, Francia). Los ratones CD45.1 C57BL/6 fueron amablemente administrados por T. Lawrence (King’s College London, Londres) y P. Barral (King’s College London, Londres).

Materials

Reagents
2-Mercaptoethanol Gibco 21985023
Anti-mouse CD45 (BV510) BioLegend 103137
Anti-mouse NK1.1 (PE) Thermo Fisher Scientific 12-5941-83
B-27 Supplement (50X), serum free Gibco 17504044
CD127 Monoclonal Antibody (APC) Thermo Fisher Scientific 17-1271-82
CD19 Monoclonal Antibody (eFluor 450) Thermo Fisher Scientific 48-0193-82
CD3e Monoclonal Antibody (eFluor 450) Thermo Fisher Scientific 48-0051-82
CD5 Monoclonal Antibody (eFluor 450) Thermo Fisher Scientific 48-0031-82
CHIR99021 Tocris 4423/10
COLLAGENASE D, 500MG Merck 11088866001
Cultrex HA- RSpondin1-Fc HEK293T Cells Cell line was used to harvest conditioned RSpondin1 supernatant, the cell line and Materials Transfer Agreement was provided by the Board of Trustees of the Lelands Stanford Junior University (Calvin Kuo, MD,PhD, Stanford University)
DISPASE II (NEUTRAL PROTEASE, GRADE II) Merck 4942078001
DMEM/F12 (1:1) (1X) Dulbecco's Modified Eagle Medium Nutrient Mixture F-12 (Advanced DMEM/F12) Gibco 11320033
DNASE I, GRADE II Merck 10104159001
Dulbecco's Modified Eagle Medium (1X) Gibco 21969-035
Ethilenediamine Tetraacetate Acid Thermo Fisher Scientific BP2482-100
FC block 2B Scientific BE0307
Fetal Bovine Serum, qualified, hear inactivated Gibco 10500064
GlutaMAX (100X) Gibco 3050-038
Hanks' Balanced Salt Solution (10X) Gibco 14065056
HBSS (1X) Gibco 12549069
HEK-293T- mNoggin-Fc Cells Cell line was used to harvest conditioned Noggin supernatant, cell line acquired through Materials Transfer Agreement with the Hubrecth Institute, Uppsalalaan8, 3584 CT Utrecht, The Netherlands, and is based on the publication by Farin, Van Es, and Clevers Gastroenterology (2012).
HEPES Buffer Solution (1M) Gibco 15630-056
KLRG1 Monoclonal Antibody (PerCP eFluor-710) Thermo Fisher Scientific 46-5893-82
Live/Dead Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation Thermo Fisher Scientific L23105
Ly-6G/Ly-6C Monoclonal Antibody (eFluor 450) Thermo Fisher Scientific 48-5931-82
Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix, Phenol Red-free, LDEV-free Corning 356231
N-2 Supplement (100X) Gibco 17502048
N-acetylcysteine (500mM) Merck A9165
NKp46 Monoclonal Antibody (PE Cyanine7) Thermo Fisher 25-3351-82
PBS (1 X) 7.2 pH Thermo Fisher Scientific 12549079
PBS (10X) Gibco 70013032
Percoll Cytiva 17089101
Recombinant Human EGF, Animal-Free Protein R&D Systems AFL236
Recombinant Human IL-15 GMP Protein, CF R&D Systems 247-GMP
Recombinant Human IL-2 (carrier free) BioLegend 589106
Recombinant Mouse IL-7 (carrier free) R&D Systems 407-ML-005/CF
UltraComp eBeads Thermo Fisher Scientific 01-2222-42
Y-27632 dihydrochloride (ROCK inhibitor) Bio-techne 1254
Plastics
50 mL tube Falcon 10788561
1.5 mL tube Eppendorf 30121023
10 mL pippette StarLab E4860-0010
15 mL tube Falcon 11507411
25 mL pippette StarLab E4860-0025
p10 pippette tips StarLab S1121-3810-C
p1000 pippette tips StarLab I1026-7810
p200 pippette tips StarLab E1011-0921
Standard tissue culture treated 24-well plate Falcon 353047
Equipment
Centrifuge Eppendorf 5810 R
CO2 and temperature controled incubator Eppendorf Galaxy 170 R/S
Flow Assisted Cellular Sorter BD equipment FACS Aria II
Heated shaker Stuart Equipment SI500
Ice box
Inverted light microscope Thermo Fisher Scientific EVOS XL Core Imaging System (AMEX1000)
p10 pippette Eppendorf 3124000016
p1000 pippette Eppendorf 3124000063
p200 pippette Eppendorf 3124000032
Pippette gun Eppendorf 4430000018
Wet ice

References

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Cite This Article
Read, E., Jowett, G. M., Coman, D., Neves, J. F. Co-Culture of Murine Small Intestine Epithelial Organoids with Innate Lymphoid Cells. J. Vis. Exp. (181), e63554, doi:10.3791/63554 (2022).

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