Контролируемые полуавтоматизированные лазерно-индуцированные повреждения для изучения регенерации спинного мозга у личинок рыбок данио
Summary
Настоящий протокол описывает способ индуцирования тканеспецифических и высоковоспроизводимых повреждений у личинок рыбок данио с использованием лазерной системы поражения в сочетании с автоматизированной микрофлюидной платформой для обработки личинок.
Abstract
Личинки рыбок данио обладают полностью функциональной центральной нервной системой (ЦНС) с высокой регенеративной способностью всего через несколько дней после оплодотворения. Это делает эту животную модель очень полезной для изучения травм и регенерации спинного мозга. Стандартным протоколом индуцирования таких поражений является трансекция дорсальной части ствола вручную. Однако эта методика требует обширной подготовки и повреждает дополнительные ткани. Был разработан протокол для лазерно-индуцированных поражений, чтобы обойти эти ограничения, что обеспечивает высокую воспроизводимость и полноту трансекции спинного мозга у многих животных и между различными сеансами, даже для неподготовленного оператора. Кроме того, повреждение тканей в основном ограничивается самим спинным мозгом, уменьшая смешанные эффекты от повреждения различных тканей, например, кожи, мышц и ЦНС. Кроме того, возможны геми-поражения спинного мозга. Улучшенное сохранение целостности тканей после лазерного повреждения облегчает дальнейшие вскрытия, необходимые для дополнительных анализов, таких как электрофизиология. Следовательно, этот метод предлагает точный контроль степени травмы, которая недостижима вручную. Это позволяет создавать новые экспериментальные парадигмы в этой мощной модели в будущем.
Introduction
В отличие от млекопитающих, рыбки данио (Danio rerio) могут восстанавливать свою центральную нервную систему (ЦНС) после травмы1. Использование личинок рыбок данио в качестве модели регенерации спинного мозга относительно недавно. Оказалось полезным исследовать клеточные и молекулярные механизмы, лежащие в основе репарации2. Это связано с простотой манипуляций, коротким экспериментальным циклом (новые личинки каждую неделю), оптической прозрачностью тканей и небольшим размером личинок, идеально подходящим для флуоресцентной микроскопии in vivo.
В случае регенерации спинного мозга двумя дополнительными преимуществами использования личинок являются скорость восстановления, несколько дней по сравнению с несколькими неделями для взрослых, и легкость индуцирования травм с использованием мануальных методов. Это было успешно использовано во многих исследованиях3,4,5, включая недавние исследования6,7. В целом, это приводит к увеличению значимого производства данных, высокой адаптивности экспериментальных протоколов и снижению экспериментальных затрат. Использование личинок моложе 5 дней после оплодотворения также снижает использование животных в соответствии с принципами 3R в исследованиях на животных8.
После травмы спинного мозга у личинок рыбок данио происходят многие биологические процессы, включая воспалительную реакцию, пролиферацию клеток, нейрогенез, миграцию выживших или вновь генерируемых клеток, реформирование функциональных аксонов и глобальное ремоделирование цепей нервных процессов и тканей позвоночника6,7,9,10 . Чтобы быть успешно организованными, эти процессы включают в себя тонко регулируемое взаимодействие между рядом типов клеток, компонентов внеклеточного матрикса и биохимических сигналов11,12. Разгадка деталей этой значительной реорганизации сложной ткани, такой как спинной мозг, требует использования и разработки точных и контролируемых экспериментальных подходов.
Основная экспериментальная парадигма, используемая для изучения регенерации спинного мозга у рыбок данио, заключается в использовании хирургических средств для индуцирования повреждения тканей путем резекции, колющего ранения или криоправмы3,13. Эти подходы имеют тот недостаток, что требуют специальной подготовки по навыкам микрохирургии, что отнимает много времени у любого нового оператора и может препятствовать их использованию в краткосрочных проектах. Кроме того, они обычно вызывают повреждение окружающих тканей, что может повлиять на регенерацию.
Другой подход заключается в том, чтобы вызвать повреждение клеток химическим путем14 или с помощью генетических манипуляций15. Последнее позволяет наносить целенаправленный урон. Однако такой метод требует длительной подготовительной работы по получению новой трансгенной рыбы перед проведением любого эксперимента, обновляемого каждый раз, когда нацеливается уникальный тип клеток.
Таким образом, существует необходимость в методе, позволяющем проводить целенаправленные, но универсальные поражения, подходящие для различных исследований в области регенерации. Решение состоит в том, чтобы использовать лазер для индуцирования локализованного повреждения в интересующей ткани16,17,18,19,20. Действительно, использование лазерно-индуцированного повреждения тканей представляет собой надежный подход к созданию поражений спинного мозга со многими преимуществами. Микроскопы, оснащенные такими модулями лазерной манипуляции, позволяют указать область индивидуальной формы, где будет происходить абляция клеток, с дополнительным преимуществом временного контроля. Таким образом, размер и положение поражения могут быть адаптированы для решения любых вопросов.
Недостающей особенностью большинства лазерных систем поражения является возможность вызывать травмы высоко воспроизводимым способом для серии личинок. Здесь описан оригинальный протокол с использованием УФ-лазера для индуцирования полуавтоматических точных и контролируемых поражений у личинок рыбок данио на основе микрофлюидной платформы, предназначенной для автоматизированной обработки личинок21. Более того, в представленной здесь системе личинки вставляются в стеклянный капилляр, что позволяет свободно вращаться животному вокруг его рострокодальной оси. Пользователь может выбрать, какую сторону личинки представить лазеру, позволяя флуоресцентной визуализации точно нацеливаться на лазерный луч и оценивать повреждение после поражения.
Протокол, описанный здесь, используется с полуавтоматизированной системой визуализации личинок рыбок данио в сочетании со вращающимся диском, оснащенным ультрафиолетовым лазером (далее обозначенным как система VAST). Однако основные пункты протокола и большинство пунктов формулы техники справедливы для любой системы, оснащенной лазером, способным к абляции клеток, включая двухфотонные лазерные сканирующие микроскопы, вращающиеся дисковые микроскопы, снабженные УФ-лазером (модуль FRAP), или видеомикроскопы с лазерным модулем для фотоманипуляции. Одно из основных различий между системой VAST и обычной обработкой проб будет заключаться в том, что для последней потребуется установка личинок в агарозе с низкой температурой плавления на стеклянных крышках / чашках Петри со стеклянным дном вместо их загрузки в 96-луночную пластину.
Преимущества, предлагаемые этим методом, открывают возможности для инновационных исследований клеточных и молекулярных механизмов в процессе регенерации. Кроме того, высокое качество данных позволяет проводить количественные исследования в междисциплинарном контексте.
Protocol
Representative Results
Discussion
Существует острая необходимость в более глубоком понимании процессов, происходящих во время регенерации у рыбок данио. Эта модель на животных предлагает много преимуществ для биомедицинских исследований, в частности для травм спинного мозга1. Большинство исследований вк…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано BBSRC (BB/S0001778/1). CR финансируется Программой стипендий Princess Royal TENOVUS Scotland Medical Research Scholarship Program. Мы благодарим Дэвида Гринальда (CRH, Эдинбургский университет) и Кэти Рид (CDBS, Эдинбургский университет) за добрый подарок трансгенной рыбы (см. Дополнительный файл). Мы благодарим Даниэля Сунга (CRH, Эдинбургский университет) за добрый доступ к конфокальному 3i-вращающемуся диску.
Materials
| Software | |||
| Microscope software Zen Blue 2.0 | Carl Zeiss | ||
| ImageJ/FIJI | Open-Source | ||
| Visual Studio Code | Microsoft | ||
| Microscope and accessories | |||
| ApoTome microscope | Carl Zeiss | ||
| C-Plan-Apochromat 10X (0.5NA) dipping lens | Carl Zeiss | ||
| dual AxioCam 506 m CCD cameras | Carl Zeiss | ||
| Laser scanning confocal microscope LSM880 | Carl Zeiss | ||
| Spinning-disk module CSU-X1 | Yokogawa | ||
| Upright microscopeAxio Examiner D1 | Carl Zeiss | ||
| UV laser | Micropoint | ||
| VAST BioImager | Union Biometrica | ||
| Labware | |||
| 90 mm Petri dish | Thermo-Fisher | 101R20 | |
| 96-well plate | Corning | 3841 | |
| Chemicals | |||
| Click-It EdU Imaging Kit | Invitrogen | C10637 | |
| aminobenzoic-acid-ethyl methyl-ester (MS222) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| Antibodies | |||
| Donkey anti-chicken Alexa Fluor 488 | Jackson | 703-545-155 | |
| Donkey anti-mouse Cy3 | Jackson | 715-165-150 | |
| Mouse anti-GFP | Abcam | AB13970 | |
| Mouse anti-tubulin acetylated antibody | Sigma | T6793 | |
| Transgenic zebrafish lines | |||
| Tg(beta-actin:utrophin-mCherry) | N/A | Established by David Greenhald, University of Edinburgh | |
| Tg(mnx1:gfp) | N/A | First described in [Flanagan-Steet et al. 2005] | |
| Tg(Xla.Tubb:DsRed) | N/A | First described in [Peri and Nusslein-Volhard 2008] | |
| Tg(Xla.Tubb:DsRed;mpeg1:GFP) | N/A | Established by Katy Reid, University of Edinburgh | |
| Tg(Xla.Tubb:GCaMP6s) | N/A | Established by David Greenhald, University of Edinburgh |
References
- Becker, C. G., Becker, T. Adult zebrafish as a model for successful central nervous system regeneration. Restorative Neurology and Neuroscience. 26 (2-3), 71-80 (2008).
- Ohnmacht, J., et al. Spinal motor neurons are regenerated after mechanical lesion and genetic ablation in larval zebrafish. Development. 143 (9), 1464-1474 (2016).
- Anguita-Salinas, C., et al. Cellular dynamics during spinal cord regeneration in larval zebrafish. Developmental Neuroscience. 41 (1-2), 112-122 (2019).
- Chapela, D., et al. A zebrafish drug screening platform boosts the discovery of novel therapeutics for spinal cord injury in mammals. Scientific Reports. 9, 1-12 (2019).
- Schlüßler, R., et al. Mechanical mapping of spinal cord growth and repair in living zebrafish larvae by brillouin imaging. Biophysical Journal. 115 (5), 911-923 (2018).
- Cavone, L., et al. A unique macrophage subpopulation signals directly to progenitor cells to promote regenerative neurogenesis in the zebrafish spinal cord. Developmental Cell. 56 (11), 1617-1630 (2021).
- Keatinge, M., et al. CRISPR gRNA phenotypic screening in zebrafish reveals pro-regenerative genes in spinal cord injury. PLoS Genetics. 17 (4), 1-21 (2021).
- . National Centre for the Replacement, Refinement and Reduction of Animals in Research Available from: https://nc3rs.org.uk (2021)
- Hui, S. P., et al. Genome wide expression profiling during spinal cord regeneration identifies comprehensive cellular responses in Zebrafish. PLOS ONE. 9 (1), 1-23 (2014).
- Vasudevan, D., et al. Regenerated interneurons integrate into locomotor circuitry following spinal cord injury. Experimental Neurology. 342, 1-10 (2021).
- Becker, T., Becker, C. G. Dynamic cell interactions allow spinal cord regeneration in zebrafish. Current Opinion in Physiology. 14, 64-69 (2020).
- Wehner, D., et al. Wnt signaling controls pro-regenerative Collagen XII in functional spinal cord regeneration in zebrafish. Nature Communications. 8 (126), 1-16 (2017).
- Briona, L. K., Dorsky, R. I. Spinal cord transection in the larval Zebrafish. Journal of Visualised Experiments: JoVE. (87), (2014).
- Kamei, C. N., Liu, Y., Drummond, I. A. Kidney regeneration in adult Zebrafish by gentamicin induced injury. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (102), (2015).
- Bhatt, D. H., Otto, S. J., Depoister, B., Fetcho, J. R. Cyclic AMP-induced repair of zebrafish spinal circuits. Science. 305 (5681), 254-258 (2004).
- Xu, Y., Chen, M., Hu, B., Huang, R., Hu, B. In vivo imaging of mitochondrial transport in single-axon regeneration of zebrafish mauthner cells. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11 (4), 1-12 (2017).
- Nichols, E. L., Smith, C. J. Functional regeneration of the sensory root via axonal invasion. Cell Reports. 30 (1), 9-17 (2020).
- Ellström, I. D., et al. Spinal cord injury in zebrafish induced by near-infrared femtosecond laser pulses. Journal of Neuroscience Methods. 311, 259-266 (2016).
- Green, L. A., Nebiolo, J. C., Smith, C. J. Microglia exit the CNS in spinal root avulsion. PLOS Biology. 17 (2), 1-30 (2019).
- Early, J. J., et al. An automated high-resolution in vivo screen in zebrafish to identify chemical regulators of myelination. eLife. , 1-31 (2018).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the Zebrafish. Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).
- . AndOr Micropoint Manual Available from: https://andor.oxinst.com/downloads/view/andor-micropoint-manual (2021)
- Knafo, S., et al. Mechanosensory neurons control the timing of spinal microcircuit selection during locomotion. eLife. 6, 25260 (2017).
- Tsarouchas, T. M., et al. Dynamic control of proinflammatory cytokines Il-1β and Tnf-α by macrophages in zebrafish spinal cord regeneration. Nature Communications. 9, (2018).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).
- Howell, D. . Statistical methods for psychology. , 324-325 (2002).
- Tukey, J. Comparing individual means in the analysis of variance. Biometrics. 5 (2), 99-114 (1949).
- Song, M., Mohamad, O., Chen, D., Yu, S. P. Coordinated development of voltage-gated Na+ and K+ currents regulates functional maturation of forebrain neurons derived from human induced pluripotent stem cells. Stem Cells and Development. 22 (10), 1551-1563 (2013).
- Hong, S., Lee, P., Baraban, S., Lee, L. P. A novel long-term, multi-channel and non-invasive electrophysiology platform for Zebrafish. Scientific Reports. 6, 1-10 (2016).
- Menelaou, E., McLean, D. L. Hierarchical control of locomotion by distinct types of spinal V2a interneurons in zebrafish. Nature Communications. 10, 1-12 (2019).
