제브라피쉬 유충의 척수 재생 연구를위한 제어 된 반자동 레이저 유도 부상
Summary
본 프로토콜은 유충 취급을 위한 자동화된 미세유체 플랫폼과 결합된 레이저 병변 시스템을 사용하여 제브라피쉬 유충에서 조직 특이적이고 재현성이 높은 부상을 유도하는 방법을 기술한다.
Abstract
Zebrafish 유충은 수정 후 며칠 만에 높은 재생 능력을 가진 완전히 기능적인 중추 신경계 (CNS)를 가지고 있습니다. 이것은이 동물 모델을 척수 손상 및 재생을 연구하는 데 매우 유용합니다. 이러한 병변을 유도하기 위한 표준 프로토콜은 트렁크의 등쪽 부분을 수동으로 횡단하는 것이다. 그러나이 기술은 광범위한 훈련이 필요하며 추가 조직을 손상시킵니다. 레이저로 인한 병변이 이러한 한계를 우회하기 위해 프로토콜이 개발되어 훈련받지 않은 작업자에게도 많은 동물과 다른 세션 사이에 척수 횡단의 높은 재현성과 완전성을 허용했습니다. 또한, 조직 손상은 주로 척수 자체에 국한되어, 다른 조직, 예를 들어, 피부, 근육 및 CNS를 손상시키는 것으로부터 혼란스러운 효과를 감소시킨다. 또한, 척수의 헤미 병변이 가능합니다. 레이저 손상 후 조직 무결성의 향상된 보존은 전기 생리학과 같은 추가 분석에 필요한 추가 해부를 용이하게합니다. 따라서이 방법은 수동으로 달성 할 수없는 부상 정도를 정확하게 제어 할 수 있습니다. 이것은 미래에이 강력한 모델에서 새로운 실험 패러다임을 허용합니다.
Introduction
포유류와는 달리, 제브라피쉬(Danio rerio)는 부상 후 중추신경계(CNS)를 회복시킬 수 있습니다1. 척수 재생을위한 모델로 제브라 피쉬 유충을 사용하는 것은 비교적 최근입니다. 수리의 기초가되는 세포 및 분자 메커니즘을 조사하는 것이 가치가 있음이 입증되었습니다2. 이것은 조작의 용이성, 짧은 실험주기 (매주 새로운 애벌레), 조직의 광학 투명성 및 유충의 작은 크기 때문에 생체 내 형광 현미경 검사에 이상적입니다.
척수 재생의 경우, 애벌레 사용의 두 가지 추가 이점은 회복 속도, 성인의 경우 몇 주에 비해 며칠, 수동 기술을 사용하여 부상을 유발할 수 있다는 것입니다. 이것은 최근의 조사6,7을 포함하여 많은 연구3,4,5에서 성공적으로 사용되었습니다. 전반적으로 이로 인해 의미 있는 데이터 생산이 증가하고 실험 프로토콜의 적응성이 높으며 실험 비용이 절감됩니다. 수정 후 5 일 미만의 유충을 사용하면 동물 연구에서 3R 원칙에 따라 동물의 사용이 줄어 듭니다.8.
제브라피쉬 유충의 척수 손상 후, 염증 반응, 세포 증식, 신경 발생, 생존 또는 새로 생성 된 세포의 이동, 기능성 축삭의 개혁, 신경 과정 회로 및 척추 조직의 글로벌 리모델링을 포함한 많은 생물학적 과정이 발생합니다6,7,9,10 . 성공적으로 조율되기 위해, 이러한 과정은 다양한 세포 유형, 세포외 매트릭스 성분 및 생화학적 신호들 사이의 미세하게 조절된 상호작용을 수반한다11,12. 척수와 같은 복잡한 조직의 이러한 중요한 재구성에 대한 세부 사항을 풀기 위해서는 정밀하고 통제 된 실험 접근법의 사용과 개발이 필요합니다.
제브라피쉬에서 척수 재생을 연구하는 데 사용되는 주요 실험 패러다임은 절제술, 찌르기 또는 냉동 손상에 의한 조직 손상을 유도하기 위해 외과 적 수단을 사용하는 것입니다3,13. 이러한 접근법은 미세 수술 기술에 대한 특정 교육이 필요하다는 단점이 있으며, 이는 새로운 운영자에게 시간이 많이 걸리고 단기 프로젝트에서 사용하지 못할 수 있습니다. 또한, 그들은 일반적으로 재생에 영향을 줄 수있는 주변 조직의 손상을 유도합니다.
또 다른 접근법은 화학적으로14 또는 유전자 조작에 의해 세포 손상을 유도하는 것이다15. 후자는 고도로 표적화 된 피해를 허용합니다. 그러나 이러한 기술은 실험을 수행하기 전에 새로운 트랜스제닉 물고기를 생성하기 위해 오랜 준비 작업이 필요하며 고유 한 세포 유형이 타겟팅 될 때마다 갱신됩니다.
따라서, 재생에 있어서의 다양한 연구에 적합한 표적화되지만 다재다능한 병변을 허용하는 방법에 대한 필요성이 존재한다. 해결책은 레이저를 사용하여 관심있는 조직에서 국소 손상을 유도하는 것입니다.16,17,18,19,20. 실제로, 레이저-유도된 조직 손상의 사용은 많은 이점을 갖는 척수 병변을 생성하기 위한 강력한 접근법을 제시한다. 이러한 레이저 조작 모듈이 장착 된 현미경을 사용하면 세포 절제가 발생할 맞춤형 모양의 영역을 지정할 수 있으며 시간적 제어의 추가 이점이 있습니다. 따라서 병변의 크기와 위치는 모든 질문을 해결하기 위해 적응 될 수 있습니다.
대부분의 레이저 병변 시스템의 누락 된 특징은 일련의 유충에 대해 재현성이 높은 방식으로 부상을 유발할 수있는 가능성입니다. 여기서 원래의 프로토콜은 UV 레이저를 사용하여 자동화 된 유충 취급을 위해 설계된 미세 유체 플랫폼을 기반으로 제브라 피쉬 유충에서 반자동화된 정밀하고 통제 된 병변을 유도하기 위해 설명됩니다21. 또한, 여기에 제시된 시스템에서 유충은 유리 모세관에 삽입되어 로스트로 코달 축 주위의 동물의 자유로운 회전을 허용합니다. 사용자는 유충의 어느 쪽이 레이저에 제시할지 선택할 수 있으며 형광 이미징이 레이저 빔을 정확하게 타겟팅하고 병변 후 손상을 평가할 수 있습니다.
여기에 설명 된 프로토콜은 UV 레이저 (이하 VAST 시스템으로 지정됨)가 장착 된 회전 디스크와 결합 된 반자동 제브라 피쉬 유충 이미징 시스템과 함께 사용됩니다. 그러나, 프로토콜의 주요 요점 및 기술의 대부분의 청구항은 이광자 레이저 스캐닝 현미경, UV 레이저(FRAP 모듈)와 함께 제공되는 방사-디스크 현미경, 또는 사진 조작을 위한 레이저 모듈을 갖는 비디오 현미경을 포함하는 세포 절제가 가능한 레이저를 장착한 임의의 시스템에 유효하다. VAST 시스템과 기존 샘플 처리의 주요 차이점 중 하나는 후자의 경우 96 웰 플레이트에 적재하는 대신 유리 커버 슬립 / 유리 바닥 페트리 접시에 저융점 아가로스에 유충을 장착해야한다는 것입니다.
이 방법이 제공하는 이점은 재생 과정에서 세포 및 분자 메커니즘에 대한 혁신적인 연구를위한 기회를 열어줍니다. 또한 높은 데이터 품질로 인해 여러 분야의 맥락에서 정량적 조사가 가능합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
제브라 피쉬에서 재생하는 동안 재생되는 과정에 대한 더 깊은 이해가 시급히 필요합니다. 이 동물 모델은 생물 의학 연구, 특히 척수 손상에 많은 이점을 제공합니다1. 대부분의 연구는 잘 훈련 된 작업자를 필요로하고 다중 조직 손상을 유도하는 수동 병변을 포함합니다. 레이저 병변 프로토콜이 여기에 제시되어 병변 특성을 제어하고 주변 조직의 손상을 줄일 수 있습니다. 또…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 BBSRC (BB/S0001778/1)에 의해 지원되었다. CR은 Princess Royal TENOVUS Scotland Medical Research Scholarship Program의 지원을 받습니다. 우리는 데이비드 그린 알드 (CRH, 에딘버러 대학)와 케이티 리드 (CDBS, 에딘버러 대학)에게 트랜스제닉 물고기의 친절한 선물에 감사드립니다 ( 보충 파일 참조). 우리는 Daniel Soong (CRH, University of Edinburgh)에게 3i 회전 디스크 공초점에 대한 친절한 접근에 감사드립니다.
Materials
| Software | |||
| Microscope software Zen Blue 2.0 | Carl Zeiss | ||
| ImageJ/FIJI | Open-Source | ||
| Visual Studio Code | Microsoft | ||
| Microscope and accessories | |||
| ApoTome microscope | Carl Zeiss | ||
| C-Plan-Apochromat 10X (0.5NA) dipping lens | Carl Zeiss | ||
| dual AxioCam 506 m CCD cameras | Carl Zeiss | ||
| Laser scanning confocal microscope LSM880 | Carl Zeiss | ||
| Spinning-disk module CSU-X1 | Yokogawa | ||
| Upright microscopeAxio Examiner D1 | Carl Zeiss | ||
| UV laser | Micropoint | ||
| VAST BioImager | Union Biometrica | ||
| Labware | |||
| 90 mm Petri dish | Thermo-Fisher | 101R20 | |
| 96-well plate | Corning | 3841 | |
| Chemicals | |||
| Click-It EdU Imaging Kit | Invitrogen | C10637 | |
| aminobenzoic-acid-ethyl methyl-ester (MS222) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| Antibodies | |||
| Donkey anti-chicken Alexa Fluor 488 | Jackson | 703-545-155 | |
| Donkey anti-mouse Cy3 | Jackson | 715-165-150 | |
| Mouse anti-GFP | Abcam | AB13970 | |
| Mouse anti-tubulin acetylated antibody | Sigma | T6793 | |
| Transgenic zebrafish lines | |||
| Tg(beta-actin:utrophin-mCherry) | N/A | Established by David Greenhald, University of Edinburgh | |
| Tg(mnx1:gfp) | N/A | First described in [Flanagan-Steet et al. 2005] | |
| Tg(Xla.Tubb:DsRed) | N/A | First described in [Peri and Nusslein-Volhard 2008] | |
| Tg(Xla.Tubb:DsRed;mpeg1:GFP) | N/A | Established by Katy Reid, University of Edinburgh | |
| Tg(Xla.Tubb:GCaMP6s) | N/A | Established by David Greenhald, University of Edinburgh |
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