כאן, אנו מציגים פרוטוקול מתוקנן לניטור החמצת המעיים ב Drosophila melanogaster עם תפוקה אופטימלית. תחילה אנו משתמשים בפרוטוקול זה לניטור החמצת המעיים ב – Drosophila melanogaster ולאחר מכן מדגימים את השימוש בו במינים שאינם מודל Drosophila .
מידגוט זבוב הפירות מורכב מאזורים מרובים, שכל אחד מהם מורכב מתאים המבצעים פונקציות פיזיולוגיות ייחודיות הנדרשות לתפקוד תקין של המעיים. אזור אחד כזה, אזור תא הנחושת (CCR), הוא מקומי לאמצע midgut והוא מורכב, בחלקו, של קבוצה של תאים המכונה תאי נחושת. תאי נחושת מעורבים בהפרשת חומצת קיבה, תהליך שנשמר אבולוציונית שתפקידם המדויק אינו מובן כהלכה. מאמר זה מתאר שיפורים בפרוטוקול הנוכחי המשמש לבדיקת החמצה של המעיים הבוגרים Drosophila melanogaster ומדגים כי ניתן להשתמש בו על מינים אחרים של זבובים. בפרט, מאמר זה מדגים כי החמצת המעיים תלויה במצב התזונתי של הזבוב ומציג פרוטוקול המבוסס על ממצא חדש זה. בסך הכל, פרוטוקול זה מדגים את התועלת הפוטנציאלית של לימוד תאי נחושת Drosophila לחשוף עקרונות כלליים שבבסיס המנגנונים של החמצת המעיים.
במעי החרקים, תאי נחושת חולקים קווי דמיון תאיים ותפקודיים עם תאי קודקוד הקיבה המייצרים חומצה (הידועים גם בשם אוקסינטי) של הקיבה היונקת. קבוצת תאים זו משחררת חומצה לתוך לומן המעי. הפונקציה של הפרשת חומצה ואנטומיה נשמרת אבולוציונית. המרכיבים העיקריים של החומצה המשוחררת הם חומצה הידרוכלורית ואשלגן כלוריד. המנגנון הכימי של היווצרות חומצה בתאים תלוי באנהידרז פחמתי. אנזים זה מייצר יון ביקרבונט מפחמן דו-חמצני ומים, אשר משחרר יון הידרוקסיל כי הוא משוחרר לאחר מכן לתוך הלומן באמצעות משאבת פרוטון בתמורה אשלגן. יוני כלוריד ואשלגן מועברים לתוך הלומן על ידי ערוצי מוליכות וכתוצאה מכך היווצרות של חומצה הידרוכלורית ואשלגן כלוריד, המרכיב העיקרי של מיץ קיבה1,2,3,4.
למרות המנגנונים של היווצרות חומצה מובנים היטב, הרבה פחות ידוע על מנגנונים פיזיולוגיים המסדירים הפרשת חומצה. המטרה של פיתוח שיטה זו היא לעזור לתאר טוב יותר את המסלולים התאיים המתאמים היווצרות חומצה והפרשת ולקבוע את תפקידה של חומצה בתיווך פיזיולוגיה מעיים והומאוסטזיס. הרציונל מאחורי ההתפתחות והשימוש בטכניקה זו הוא לספק שיטה עקבית ואמינה ללמוד את תהליך החמצת המעיים בדרוזופילה ואורגניזמים שאינם מודל. למרות פרוטוקול סטנדרטי לקביעת חמצת midgut Drosophila קיים כיום 2,5,6, שונות משמעותית נצפתה במידת החמצה זבובים מסוג בר (WT) בעת שימוש בפרוטוקול זה לחקר תפקוד תאי נחושת. כדי להבין את הבסיס לשונות נצפתה זו ולקבל תוצאות עקביות, מספר היבטים של הפרוטוקול הסטנדרטי היו ממוטבים כמתואר להלן.
צעד קריטי בפרוטוקול זה הוא החיתוך הנכון של המעיים כדי לדמיין את CCR עבור פנוטיפ החמצה. החומצה המשתחררת מתאי הנחושת מוגבלת ל- CCR כאשר המעיים שלמים. עם זאת, במהלך ניתוח, דליפה הנגרמת על ידי קרע של המעי יכול להוביל דיפוזיה של חומצה מן CCR ולגרום המעי בטעות ציון שלילי עבור החמצה. בנוסף, הצבע הצהוב המ…
The authors have nothing to disclose.
המחברים מכירים בכך שהתמיכה בעבודה במעבדה של המחבר ניתנת על ידי פרס חוקר הפקולטה של HHMI וקרנות סטארט-אפ ממכון המחקר לילדים במרכז הרפואי UT Southwestern.
Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B0126 | |
cellSens software | Olympus | Image aqusition (https://www.olympus-lifescience.com/en/software/cellsens) | |
D. simulans | Drosophila Species Stock Center at the University of California | Riverside California1 (https://www.drosophilaspecies.com/) | |
D. erecta | Drosophila Species Stock Center at the University of California | Dere cy1(https://www.drosophilaspecies.com/) | |
D. pseudoobscura | Drosophila Species Stock Center at the University of California | Eugene, Oregon(https://www.drosophilaspecies.com/) | |
D. mojavensis | Drosophila Species Stock Center at the University of California | Chocolate Mountains, California (https://www.drosophilaspecies.com/) | |
Forceps | Inox Biology | Catalog# 11252-20 | |
Fuji | Fuji | Image processing (https://hpc.nih.gov/apps/Fiji.html) | |
Glass slide | VWR | Catalog#16005-108 | |
Kim wipes Tissue | Kimtech | ||
Microscope and camera | Olympus SZ61 microscope equipped with an Olympus D-27 digital camera | Imaging | |
Oregon R | Bloomington Drosophila Stock | (https://bdsc.indiana.edu/ # 2376) | |
Petri dishes | Fisher Scientific | Catalog #FB0875713A | |
Phosphate-buffered Saline (PBS) | HyClone | Catalog # SH30258.01 | |
Stereomicroscope | Olympus SZ51 | Visual magnification |