Ici, nous présentons un protocole standardisé pour surveiller l’acidification intestinale chez Drosophila melanogaster avec un rendement optimal. Nous utilisons d’abord ce protocole pour la surveillance de l’acidification intestinale chez Drosophila melanogaster , puis démontrons son utilisation chez les espèces de drosophila non modèles.
L’intestin moyen de la mouche des fruits se compose de plusieurs régions, chacune composée de cellules qui remplissent des fonctions physiologiques uniques nécessaires au bon fonctionnement de l’intestin. L’une de ces régions, la région des cellules de cuivre (CCR), est localisée dans l’intestin moyen et se compose, en partie, d’un groupe de cellules appelées cellules de cuivre. Les cellules de cuivre sont impliquées dans la sécrétion d’acide gastrique, un processus conservé de manière évolutive dont le rôle précis est mal compris. Cet article décrit les améliorations apportées au protocole actuel utilisé pour tester l’acidification de l’intestin adulte de Drosophila melanogaster et démontre qu’il peut être utilisé sur d’autres espèces de mouches. En particulier, cet article démontre que l’acidification intestinale dépend de l’état nutritionnel de la mouche et présente un protocole basé sur cette nouvelle découverte. Dans l’ensemble, ce protocole démontre l’utilité potentielle de l’étude des cellules de cuivre de la drosophile pour découvrir les principes généraux sous-jacents aux mécanismes de l’acidification intestinale.
Dans l’intestin de l’insecte, les cellules de cuivre partagent des similitudes cellulaires et fonctionnelles avec les cellules pariétales gastriques productrices d’acide (également appelées oxyntiques) de l’estomac des mammifères. Ce groupe de cellules libère de l’acide dans la lumière intestinale. La fonction de la sécrétion acide et de l’anatomie est conservée de manière évolutive. Les principaux composants de l’acide rejeté sont l’acide chlorhydrique et le chlorure de potassium. Le mécanisme chimique de formation d’acide dans les cellules dépend de l’anhydrase carbonique. Cette enzyme génère un ion bicarbonate à partir du CO2 et de l’eau, qui libère un ion hydroxyle qui est ensuite rejeté dans la lumière par une pompe à protons en échange de potassium. Les ions chlorure et potassium sont transportés dans la lumière par des canaux de conductance entraînant la formation d’acide chlorhydrique et de chlorure de potassium, le composant principal du suc gastrique1,2,3,4.
Bien que les mécanismes de formation d’acide soient bien compris, on en sait beaucoup moins sur les mécanismes physiologiques qui régulent la sécrétion d’acide. L’objectif du développement de cette méthode est d’aider à mieux délimiter les voies cellulaires qui coordonnent la formation et la sécrétion d’acide et de déterminer le rôle de l’acide dans la médiation de la physiologie intestinale et de l’homéostasie. La raison d’être du développement et de l’utilisation de cette technique est de fournir une méthode cohérente et fiable pour étudier le processus d’acidification intestinale chez la drosophile et les organismes non modèles. Bien qu’il existe actuellement un protocole standard pour déterminer l’acidification de l’intestin moyen de la drosophile2,5,6, une variabilité significative a été observée dans l’étendue de l’acidification chez les mouches de type sauvage (WT) lors de l’utilisation de ce protocole pour étudier la fonction des cellules de cuivre. Pour comprendre la base de cette variabilité observée et obtenir des résultats cohérents, plusieurs aspects du protocole standard ont été optimisés comme décrit ci-dessous.
Une étape critique de ce protocole est la dissection appropriée de l’intestin pour visualiser le CCR pour le phénotype d’acidification. L’acide libéré par les cellules de cuivre est confiné au CCR lorsque l’intestin est intact. Cependant, lors de la dissection, une fuite causée par une rupture de l’intestin peut entraîner la diffusion de l’acide du CCR et entraîner un intestin marqué par erreur comme négatif pour l’acidification. En outre, la couleur jaune indicative de l’acidification s’esto…
The authors have nothing to disclose.
Les auteurs reconnaissent que le soutien au travail dans le laboratoire de l’auteur est fourni par un HHMI Faculty Scholar Award et des fonds de démarrage du Children’s Research Institute du UT Southwestern Medical Center.
Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B0126 | |
cellSens software | Olympus | Image aqusition (https://www.olympus-lifescience.com/en/software/cellsens) | |
D. simulans | Drosophila Species Stock Center at the University of California | Riverside California1 (https://www.drosophilaspecies.com/) | |
D. erecta | Drosophila Species Stock Center at the University of California | Dere cy1(https://www.drosophilaspecies.com/) | |
D. pseudoobscura | Drosophila Species Stock Center at the University of California | Eugene, Oregon(https://www.drosophilaspecies.com/) | |
D. mojavensis | Drosophila Species Stock Center at the University of California | Chocolate Mountains, California (https://www.drosophilaspecies.com/) | |
Forceps | Inox Biology | Catalog# 11252-20 | |
Fuji | Fuji | Image processing (https://hpc.nih.gov/apps/Fiji.html) | |
Glass slide | VWR | Catalog#16005-108 | |
Kim wipes Tissue | Kimtech | ||
Microscope and camera | Olympus SZ61 microscope equipped with an Olympus D-27 digital camera | Imaging | |
Oregon R | Bloomington Drosophila Stock | (https://bdsc.indiana.edu/ # 2376) | |
Petri dishes | Fisher Scientific | Catalog #FB0875713A | |
Phosphate-buffered Saline (PBS) | HyClone | Catalog # SH30258.01 | |
Stereomicroscope | Olympus SZ51 | Visual magnification |