هنا ، نقدم بروتوكولا موحدا لمراقبة تحمض الأمعاء في ذبابة الفاكهة مع الإخراج الأمثل. نستخدم هذا البروتوكول أولا لمراقبة تحمض الأمعاء في ذبابة الفاكهة الميلانوغاستر ثم نظهر استخدامه في أنواع ذبابة الفاكهة غير النموذجية.
تتكون ذبابة الفاكهة midgut من مناطق متعددة ، يتكون كل منها من خلايا تقوم بوظائف فسيولوجية فريدة مطلوبة لحسن سير العمل في الأمعاء. إحدى هذه المناطق ، منطقة الخلايا النحاسية (CCR) ، موضعية في منتصف الأمعاء الوسطى وتتكون ، جزئيا ، من مجموعة من الخلايا المعروفة باسم الخلايا النحاسية. تشارك الخلايا النحاسية في إفراز حمض المعدة ، وهي عملية محفوظة تطوريا ودورها الدقيق غير مفهوم بشكل جيد. تصف هذه الورقة التحسينات في البروتوكول الحالي المستخدم لفحص تحمض أمعاء ذبابة الفاكهة الميلانوغاستر البالغة وتوضح أنه يمكن استخدامه على أنواع أخرى من الذباب. على وجه الخصوص ، توضح هذه الورقة أن تحمض الأمعاء يعتمد على الحالة الغذائية للذبابة ويقدم بروتوكولا يعتمد على هذه النتيجة الجديدة. بشكل عام ، يوضح هذا البروتوكول الفائدة المحتملة لدراسة خلايا ذبابة الفاكهة النحاسية للكشف عن المبادئ العامة الكامنة وراء آليات تحمض الأمعاء.
في أمعاء الحشرات ، تشترك الخلايا النحاسية في أوجه تشابه خلوية ووظيفية مع الخلايا الجدارية المعدية المنتجة للحمض (المعروفة أيضا باسم oxyntic) في معدة الثدييات. هذه المجموعة من الخلايا تطلق الحمض في تجويف الأمعاء. يتم الحفاظ على وظيفة إفراز الحمض والتشريح تطوريا. المكونات الرئيسية للحمض المفرغ هي حمض الهيدروكلوريك وكلوريد البوتاسيوم. تعتمد الآلية الكيميائية لتكوين الحمض في الخلايا على الأنهيدراز الكربوني. يولد هذا الإنزيم أيون بيكربونات من CO2 والماء ، والذي يحرر أيون الهيدروكسيل الذي يتم تفريغه بعد ذلك في التجويف من خلال مضخة بروتون مقابل البوتاسيوم. يتم نقل أيونات الكلوريد والبوتاسيوم إلى التجويف عن طريق قنوات التوصيل مما يؤدي إلى تكوين حمض الهيدروكلوريك وكلوريد البوتاسيوم ، المكون الرئيسي لعصير المعدة 1،2،3،4.
على الرغم من أن آليات تكوين الحمض مفهومة جيدا ، إلا أنه لا يعرف الكثير عن الآليات الفسيولوجية التي تنظم إفراز الحمض. الهدف من تطوير هذه الطريقة هو المساعدة في تحديد المسارات الخلوية التي تنسق تكوين الحمض وإفرازه بشكل أفضل وتحديد دور الحمض في التوسط في فسيولوجيا الأمعاء والتوازن. الأساس المنطقي وراء تطوير واستخدام هذه التقنية هو توفير طريقة متسقة وموثوقة لدراسة عملية تحمض الأمعاء في ذبابة الفاكهة والكائنات الحية غير النموذجية. على الرغم من وجود بروتوكول قياسي لتحديد تحمض ذبابة الفاكهة في منتصف الأمعاء حاليا2,5,6 ، فقد لوحظ تباين كبير في مدى التحمض في الذباب من النوع البري (WT) أثناء استخدام هذا البروتوكول لدراسة وظيفة الخلايا النحاسية. لفهم أساس هذا التباين الملحوظ والحصول على نتائج متسقة ، تم تحسين العديد من جوانب البروتوكول القياسي كما هو موضح أدناه.
الخطوة الحاسمة في هذا البروتوكول هي التشريح السليم للأمعاء لتصور CCR للنمط الظاهري للتحمض. يقتصر الحمض المنبعث من الخلايا النحاسية على CCR عندما تكون الأمعاء سليمة. ومع ذلك ، أثناء التشريح ، يمكن أن يؤدي التسرب الناجم عن تمزق الأمعاء إلى انتشار الحمض من CCR ويؤدي إلى تسجيل الأمعاء عن طريق الخط…
The authors have nothing to disclose.
يعترف المؤلفون بأن الدعم للعمل في مختبر المؤلف يتم توفيره من خلال جائزة HHMI College Scholar Award وصناديق بدء التشغيل من معهد أبحاث الأطفال في مركز UT Southwestern الطبي.
Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B0126 | |
cellSens software | Olympus | Image aqusition (https://www.olympus-lifescience.com/en/software/cellsens) | |
D. simulans | Drosophila Species Stock Center at the University of California | Riverside California1 (https://www.drosophilaspecies.com/) | |
D. erecta | Drosophila Species Stock Center at the University of California | Dere cy1(https://www.drosophilaspecies.com/) | |
D. pseudoobscura | Drosophila Species Stock Center at the University of California | Eugene, Oregon(https://www.drosophilaspecies.com/) | |
D. mojavensis | Drosophila Species Stock Center at the University of California | Chocolate Mountains, California (https://www.drosophilaspecies.com/) | |
Forceps | Inox Biology | Catalog# 11252-20 | |
Fuji | Fuji | Image processing (https://hpc.nih.gov/apps/Fiji.html) | |
Glass slide | VWR | Catalog#16005-108 | |
Kim wipes Tissue | Kimtech | ||
Microscope and camera | Olympus SZ61 microscope equipped with an Olympus D-27 digital camera | Imaging | |
Oregon R | Bloomington Drosophila Stock | (https://bdsc.indiana.edu/ # 2376) | |
Petri dishes | Fisher Scientific | Catalog #FB0875713A | |
Phosphate-buffered Saline (PBS) | HyClone | Catalog # SH30258.01 | |
Stereomicroscope | Olympus SZ51 | Visual magnification |