비리오크크레아티드 덕트에 타우로콜레이트 나트륨의 역행 주입을 사용하여 마우스 심각한 급성 췌장염 모델의 설립
Summary
중증 급성 췌장염의 마우스 모델은 본원에 기재된다. 여기에 제시된 절차는 매우 빠르고 간단하며 접근 가능하므로 잠재적으로 분자 메커니즘및 급성 췌장염의 다른 치료 내정간섭에 대한 연구가 편리한 방법으로 허용됩니다.
Abstract
급성 췌장염의 보급 (AP), 특히 심한 급성 췌장염 (SAP), 매년 젊은 연령 그룹에서 증가. 그러나, 현재 임상 실습에 효과적인 치료의 부족이 있다. 형질 전환 및 녹아웃 균주의 쉬운 접근성과 생체 내 평가에 필요한 약물의 최소 용량을 허용하는 작은 크기로, 마우스에서 잘 확립 된 실험 모델은 AP 연구에 선호됩니다. 더욱이, 타우로콜레이트 나트륨(TC)을 통해 유도된 SAP는 현재 가장 널리 사용되고 가장 잘 특징적인 모델 중 하나입니다. 이 모형은 AP의 프로세스 도중 새로운 치료 및 가능한 분자 사건을 위해 조사되었습니다. 여기서는 타우로콜레이트 나트륨과 간단한 수제 현미경을 이용한 AP 마우스 모델의 생성을 소개합니다. 또한, 우리는 또한 후속 조직학 및 세로가지 시험을 위한 방법론을 제공합니다.
Introduction
급성 췌장염 (AP)은 비정상적으로 활성화 된 효소에 의해 후속 덕트 팽창 및 췌장 자가 소화를 가진 주요 췌장 덕트의 방해를 특징으로하는 췌장의 급성 염증입니다. 그것의 임상 표현은 현지 또는 전신 염증, 복통 및 혈청 아밀라세1,2의 고도를 포함합니다. 심각도 분류3에 따르면 AP는 경미하고, 온건하고, 심한 형태로 존재할 수 있으며, 그 중 심각한 급성 췌장염(SAP)은 30%4 이상의 높은 사망률로 인해 가장 심각한 급성 췌장염(SAP)이 가장 우려되는 상태입니다. 미국에서 AP는 200,000명 이상의 환자에 영향을 미치는 입원의 가장 흔한 이유 중 하나입니다5. 더욱이 AP, 특히 SAP는 매년 증가하고 젊은 연령집단에 영향을 미치고 있다6. 그러나, 현재 임상 실습에 효과적인 치료 옵션의 부족이있다6,7. 따라서 AP에 관련된 분자 메커니즘을 탐구하여 치료 개선을 촉진할 필요가 있습니다.
잘 확립 된 실험 동물 모델은 AP에 관련된 메커니즘을 연구하고 다른 치료 양식의 효과를 평가하기 위해 필요합니다. 형질 전환 및 녹아웃 균주의 쉬운 접근성과 생체 내 평가에 필요한 약물의 용량을 최소화하는 작은 크기로, 마우스는 AP 연구에 선호됩니다. 따라서, AP의 몇몇 모형은 마우스8,9에서 개발되었습니다.
caeruleinin10의 정맥 투여를 통해 유도된 온화한 췌장염 쥐 모델에서 작업한 Niederau et al.은 동일한 약물 및 주사 경로를 사용하여 유도된 아시나르 세포 괴사로 제시된 SAP 마우스 모델을 개발했다. 이 모델은 비침습성, 신속한 유도, 넓은 재현성 및 적용가능성을 포함한 몇 가지 장점을 가지고 있지만, 가장 큰 단점은 대부분의 경우 온화한 형태의 AP만이 개발되어 임상 관련성을 제한한다는 것입니다. 알코올은 AP의 주요 과인자 중 하나로 간주됩니다. 그러나, Foitzik 외. 외는 외크림 과자극12와 같은 그밖 요인과 결합될 때만 췌장 상해를 일으키는 원인이 된다는 것을 보고했습니다. 더욱이, 알콜 유도 AP 모형은 다른 행정 경로를 통해 개발되고, 약 복용량이 보고되고 있더라도, 그들의 주요 단점은 그(것)들을 재생하는 어려움입니다. L-아르기닌의 복막 투여는 마우스16에서 AP를 유도할 수 있다; 그러나, 그것의 낮은 임상 관련성은 그것의 응용프로그램을 방해합니다. 황소 자리, 담즙 소금, 먼저 췌장 덕트 주입을 통해 인간의 AP를 닮은 조건을 유도하기 위한 1965 년에 Creutzfeld 외. 에 의해 제안 되었다17. 병리학학18,19의 임상 관련성에 관한 논쟁이 존재하지만, 타우로콜린성 유도 췌장염은 SAP에 필수적인 모델로 남아 있습니다.
이 모델은 실현하기 쉽고 마우스에도 효과적이기 때문에, 이제 생체 내 연구에서 작은 동물을 위한 가장 많이 사용되는 AP 모델 중 하나입니다. Perides 외. 마우스20에서 SAP를 유도하기 위해 타우로콜레이트 나트륨(TC)을 고용하여 병리학을 이해하는 통찰력을 제공했습니다. 유전자 변형 기술과 결합된 이 모델은 AP에 관련된 몇 가지 특정 유전자를 확인할 수 있게 되었습니다. 예를 들어, Bicozo 외. CD38 유전자의 녹아웃은 TC-주입 췌장염의 모델에 대하여 보호되고 세포내 Ca2+ signaling21에 있는 변경에 기계장치를 기인한다는 것을 보여주었습니다. Fanczal 외. 마우스 췌장 아시나르 및 덕트 세포의 혈장 막에서 TRPM2 발현의 생리적 의미를 조사하고 TRPM2 녹아웃 mice22에서 TC 유도 SAP의 감소된 심각도를 입증하였다. 또한,이 모델은 또한 생체 내에서 많은 새로운 약물을 테스트하는 간단하고 효과적인 방법을 제공합니다. 예를 들어, 이 방법은 카페인23, 탈수성산24 및 다양한 항산화제 및 항응고제25,26의 치료 효과를 검증가능하게 하였다. 이 증거는 TC 유도 SAP 모델의 다재다능함을 보여줍니다. Wittel 외는 유사한 마우스 모델을 설명했지만27, 구현 절차에 대한 세부 사항의 부족은 결과를 재현 할 수없는 발생할 수 있습니다. 이 기사에서는 간단한 수제 현미경을 이용한 방법에 초점을 맞추고 TC 유도 SAP를 연구하여 AP의 발병 및 치료에 대한 추가 연구뿐만 아니라 다른 많은 물질에 완벽하게 적응할 수 있는 실험 방법을 위한 가능한 지침을 제공합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
TC 유도 SAP 모델은 우수한 연구 도구입니다. 이 연구에서 와 같이,이 모델은 특정 장치를 사용하지 않고 일반 실험실에서 매우 쉽게 실현됩니다. 조직학 및 생화학적 분석과 함께 사용될 경우 AP를 유도하고 평가하기 위한 비용-(저렴한 시약) 및 시간 절약(24h 시간 창) 접근법을 제공합니다. TC의 농도조정은 또한 SAP를 유도하기 위해 TC를 고용하여 마우스20에 SAP를 유도할 수 있는 가…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NCRCH [2020WSA01]의 번역 연구 보조금, 소주건강위원회(KJXW20200002)의 KJXW 과학교부금, 소주시 과학기술계획(SKY2021038 및 SKJY2021050), 장쑤고등교육기관(PAPD)의 우선학술프로그램 개발 보조금, 1차 연구사회개발계획(PAPD)을 지원한다.
Materials
| 0.5% iodophor | Shanghai Likang Disinfectant | 310102 | 4 mL/mouse |
| 0.9% sodium chloride | Sinopharm Group Co., Ltd. | 10019318 | 0.8 mL/mouse |
| 1% Pentobarbital sodium | Sigma | P3761 | 0.2 -0.25 mL/mouse |
| 25 μL flat tip Microliter syringe | Gaoge, Shanghai | A124019 | |
| 4% Paraformaldehyde | Beyotime, Nantong, China | P0099-500ml | |
| 5% sodium taurocholate (TC) | Aladdin | S100834-5g | 10 μL/SAP mouse |
| 6-0 Sterile nylon microsuture with threaded needle (1/2 circle) | Cheng-He | 20093 | |
| 75% alcohol | Sinopharm Group Co., Ltd. | 10009218 | 4 mL/mouse |
| 8-0 Sterile nylon microsuture with threaded needle (3/8 circle) | Cheng-He | 19064 | |
| ALT Activity Assay Kit | EPNK, Anhui, China | ALT0012 | |
| Amylase Assay Kit | EPNK, Anhui, China | AMY0012 | |
| Angled small bulldog clamp with 12 mm jaw (3 cm) | Cheng-He | HC-X022 | |
| aspen shavings or shreds for mouse bedding | Beijing Vital River Laboratory Animal Technology | VR03015 | |
| AST Activity Assay Kit | EPNK, Anhui, China | AST0012 | |
| Blood Urea Nitrogen (BUN) Assay Kit | EPNK, Anhui, China | BUN0011 | |
| C57BL/6 mouse | Beijing Vital River Laboratory Animal Technology | 213 | |
| Creatine Assay Kit | EPNK, Anhui, China | CRE0012 | |
| Feature microtome blade | Beyotime, Nantong, China | E0994 | |
| Hemostatic Forceps (9.5 cm, Curved) | JZ, Shanghai Medical Instruments Co. Ltd. | JC3901 | |
| Lipase Assay Kit | Jiancheng, Nanjing, China | A054-2-1 | |
| Microtome | Leica biosystem, Germany | RM2245 | |
| Mindray biochemistry analyzer | Mindray, Shenzhen, China | BS-420 | |
| MPO Assay Kit | Jiancheng, Nanjing, China | A044-1-1 | |
| Normal mouse chow | Trophic, Nantong, China | LAD 1000 | |
| Phosphate buffered saline | Beyotime, Nantong, China | C0221A | |
| Straight micro-bulldog clamp with 5 mm jaw (1.5 cm) | JZ, Shanghai Medical Instruments Co. Ltd. | W40130 | |
| Straight or curved forceps (11.0 cm) | Cheng-He | HC-X091A or HC-X090A | |
| Straight Scissors (10.0 cm) | Cheng-He, Ningbo, China | HC-J039102 | |
| Thermo Scientific Centrifuge | Thermo Scientific, USA | Multifuge X1R |
References
- Lee, P. J., Papachristou, G. I. New insights into acute pancreatitis. Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology. 16 (8), 479-496 (2019).
- Mandalia, A., Wamsteker, E. J., DiMagno, M. J. Recent advances in understanding and managing acute pancreatitis. F1000Research. 7, 959 (2018).
- Banks, P. A., et al. Classification of acute pancreatitis-2012: revision of the Atlanta classification and definitions by international consensus. Gut. 62 (1), 102-111 (2013).
- Munir, F., et al. Advances in immunomodulatory therapy for severe acute pancreatitis. Immunology Letters. 217, 72-76 (2020).
- Peery, A. F., et al. Burden of gastrointestinal disease in the United States: 2012 update. Gastroenterology. 143 (5), 1179-1187 (2012).
- Hines, O. J., Pandol, S. J. Management of severe acute pancreatitis. BMJ. 367, 6227 (2019).
- James, T. W., Crockett, S. D. Management of acute pancreatitis in the first 72 hours. Current Opinion in Gastroenterology. 34 (5), 330-335 (2018).
- Silva-Vaz, P., et al. Murine models of acute pancreatitis: a critical appraisal of clinical relevance. International Journal of Molecular Sciences. 20 (11), 2794 (2019).
- Hyun, J. J., Lee, H. S. Experimental models of pancreatitis. Clinical Endoscopy. 47 (3), 212-216 (2014).
- Renner, I. G., Wisner, J. R., Rinderknecht, H. Protective effects of exogenous secretin on ceruletide-induced acute pancreatitis in the rat. Journal of Clinical Investigation. 72 (3), 1081-1092 (1983).
- Niederau, C., Ferrell, L. D., Grendell, J. H. Caerulein-induced acute necrotizing pancreatitis in mice: protective effects of proglumide, benzotript, and secretin. Gastroenterology. 88 (5), 1192-1204 (1985).
- Foitzik, T., et al. Exocrine hyperstimulation but not pancreatic duct obstruction increases the susceptibility to alcohol-related pancreatic injury. Archives in Surgery. 129 (10), 1081-1085 (1994).
- Schneider, L., Dieckmann, R., Hackert, T., Gebhard, M. M., Werner, J. Acute alcohol-induced pancreatic injury is similar with intravenous and intragastric routes of alcohol administration. Pancreas. 43 (1), 69-74 (2014).
- Huang, W., et al. Fatty acid ethyl ester synthase inhibition ameliorates ethanol-induced Ca2+-dependent mitochondrial dysfunction and acute pancreatitis. Gut. 63 (8), 1313-1324 (2014).
- Sun, J., et al. NRF2 mitigates acute alcohol-induced hepatic and pancreatic injury in mice. Food and Chemical Toxicology. 121, 495-503 (2018).
- Kui, B., et al. New insights into the methodology of L-arginine-induced acute pancreatitis. PLoS One. 10 (2), 0117588 (2015).
- Creutzfeldt, W., Schmidt, H., Horbach, I. Studies on the effects of a trypsin inhibitor (Trasylol) on Enzyme activities and morphology in taurocholate and calciphylaxis pancreatitis of the rat (a contribution to the pathogenesis of pancreatitis). Klin Wochenschr. 43, 15-22 (1965).
- Liu, Z. H., et al. A simple taurocholate-induced model of severe acute pancreatitis in rats. World Journal of Gastroenterology. 15 (45), 5732-5739 (2009).
- Cavdar, F., et al. Controversial issues in biliary pancreatitis: when should we perform MRCP and ERCP. Pancreatology. 14 (5), 411-414 (2014).
- Perides, G., van Acker, G. J., Laukkarinen, J. M., Steer, M. L. Experimental acute biliary pancreatitis induced by retrograde infusion of bile acids into the mouse pancreatic duct. Nature Protocols. 5 (2), 335-341 (2010).
- Orabi, A. I., et al. Cluster of differentiation 38 (CD38) mediates bile acid-induced acinar cell injury and pancreatitis through cyclic ADP-ribose and intracellular calcium release. Journal of Biological Chemistry. 288 (38), 27128-27137 (2013).
- Fanczal, J., et al. TRPM2-mediated extracellular Ca(2+) entry promotes acinar cell necrosis in biliary acute pancreatitis. Journal of Physiology. 598 (6), 1253-1270 (2020).
- Huang, W., et al. Caffeine protects against experimental acute pancreatitis by inhibition of inositol 1,4,5-trisphosphate receptor-mediated Ca2+ release. Gut. 66 (2), 301-313 (2017).
- Zhang, X., et al. Dehydrocholic acid ameliorates sodium taurocholate-induced acute biliary pancreatitis in mice. Biology and Pharmaceutical Bulletin. 43 (6), 985-993 (2020).
- Hagiwara, S., et al. Antithrombin III prevents cerulein-induced acute pancreatitis in rats. Pancreas. 38 (7), 746-751 (2009).
- Hagiwara, S., et al. Danaparoid sodium prevents cerulein-induced acute pancreatitis in rats. Shock. 32 (1), 94-99 (2009).
- Wittel, U. A., et al. Taurocholate-induced pancreatitis: a model of severe necrotizing pancreatitis in mice. Pancreas. 36 (2), 9-21 (2008).
- Barlass, U., et al. Morphine worsens the severity and prevents pancreatic regeneration in mouse models of acute pancreatitis. Gut. 67 (4), 600-602 (2018).
- Wu, D., et al. A systematic review of NSAIDs treatment for acute pancreatitis in animal studies and clinical trials. Clinical Research in Hepatology and Gastroenterology. 44, 100002 (2020).
- Schmidt, J., et al. A better model of acute pancreatitis for evaluating therapy. Annals in Surgery. 215 (1), 44-56 (1992).
- Junyuan, Z., et al. Quercetin protects against intestinal barrier disruption and inflammation in acute necrotizing pancreatitis through TLR4/MyD88/p38MAPK and ERS inhibition. Pancreatology. 18 (7), 742-752 (2018).
- Waldron, R. T., et al. The Orai Ca(2+) channel inhibitor CM4620 targets both parenchymal and immune cells to reduce inflammation in experimental acute pancreatitis. Journal of Physiology. 597 (12), 3085-3105 (2019).
- Petersen, O. H., Gerasimenko, J. V., Gerasimenko, O. V., Gryshchenko, O., Peng, S. The roles of calcium and ATP in the physiology and pathology of the exocrine pancreas. Physiological Reviews. 101 (4), 1691-1744 (2021).
