ビリオ膵管へのタウロコール酸ナトリウムの逆行性注入を用いたマウス重症急性膵炎モデルの確立
Summary
重篤な急性膵炎のマウスモデルが本明細書に記載されている。ここで提示された手順は非常に迅速で、単純で、アクセスしやすく、それによって潜在的に急性膵炎における分子メカニズムおよび異なる治療介入を便利な方法で研究することを可能にする。
Abstract
急性膵炎(AP)、特に重度の急性膵炎(SAP)の有病率は、若い年齢層で毎年増加しています。しかしながら、現在の臨床現場では有効な治療法が不足している。トランスジェニック株およびノックアウト株の入手が容易で、そのサイズが小さく、 in vivo 評価に必要な薬物の投与量を最小限に抑えることができるため、マウスにおける十分に確立された実験モデルがAP研究に好まれます。さらに、タウロコール酸ナトリウム(TC)を介して誘導されたSAPは、現在、最も広く使用されており、最も特徴付けられるモデルの1つである。このモデルは、APのプロセス中の新規治療法および可能な分子事象について調査されている。ここでは、タウロコール酸ナトリウムと簡単な自家製マイクロシリンジを用いたAPマウスモデルの作製を紹介します。さらに、その後の組織学および血清学的検査のための方法論も提供する。
Introduction
急性膵炎(AP)は、その異常に活性化された酵素によるその後の管膨満および膵臓自己消化を伴う主要な膵管の閉塞を特徴とする膵臓の急性炎症である。その臨床症状には、局所的または全身性の炎症、腹痛、および血清アミラーゼの上昇が含まれる1,2。重症度分類3によると、APは軽度、中等度、重篤な形態で存在する可能性があり、その中でも、重度の急性膵炎(SAP)は、30%を超える高い死亡率のために最も懸念される状態である4。米国では、AP通信が入院の最も一般的な理由の1つであり、20万人以上の患者に影響を与えています5。さらに、AP、特にSAPは年々増加しており、若い年齢層に影響を与えています6。しかし、現在の臨床現場では効果的な治療法の選択肢が不足しています6,7。そのため、APに関与する分子機構を探究する必要があり、治療改善が容易になる。
APに関与するメカニズムを研究し、さまざまな治療モダリティの有効性を評価するためには、十分に確立された実験動物モデルが必要です。トランスジェニック株およびノックアウト株の容易なアクセス性と、in vivo評価に必要な薬物の用量を最小限に抑える小さなサイズにより、マウスはAP研究に好まれています。したがって、APのいくつかのモデルがマウスで開発されている8,9。
Niederauらは、カエルレイン10の静脈内投与によって誘導された軽度の膵炎ラットモデルから研究し、注射経路と同じ薬剤を用いて誘導された腺房細胞壊死を提示するSAPマウスモデルを開発しました11。このモデルには、非侵襲性、迅速な誘導、広い再現性、および適用性を含むいくつかの利点がありますが、主な欠点は、ほとんどの場合、軽度の形態のAPのみが開発され、それによってその臨床的関連性が制限されることです。アルコールはAPの主要な病因の1つと考えられています。しかし、Foitzikらは、外分泌過剰刺激などの他の要因と組み合わされた場合にのみ膵臓損傷を引き起こすと報告した12。さらに、アルコール誘発APモデルは、異なる投与経路および薬物用量を介して開発されたことが報告されているが13、14、15、それらの主な欠点は、それらを再現することの難しさである。L-アルギニンの腹腔内投与はまた、マウスにおいてAPを誘導することができる16;しかし、その低い臨床的関連性は、その適用を妨げる。胆汁酸塩であるタウロコール酸塩は、膵管注入を介してヒトAPに似た状態を誘導するために、1965年にCreutzfeldらによって最初に提案された17。病態生理学におけるその臨床的関連性については論争が存在しますが18,19、タウロコール酸誘発膵炎は依然としてSAPにとって不可欠なモデルです。
このモデルは実現が簡単で、マウスでも有効であるため、現在では小動物のin vivo研究に最も使用されているAPモデルの1つです。Peridesらは、タウロコール酸ナトリウム(TC)を用いてマウス20においてSAPを誘導し、その病理を理解するための洞察を提供した。遺伝子改変技術と組み合わせることで、このモデルにより、APに関与するいくつかの特定の遺伝子を確認することができました。例えば、Bicozoらは、CD38遺伝子のノックアウトがTC注入膵炎のモデルに対して保護され、そのメカニズムを細胞内Ca2+シグナル伝達の変化に帰することを示した21。Fanczalらは、マウス膵臓腺房および乳管細胞の原形質膜におけるTRPM2発現の生理学的影響を調査し、TRPM2ノックアウトマウスにおけるTC誘導SAPの重症度の低下を実証した22。さらに、このモデルは、インビボで多くの新規薬物を試験するための簡単で効果的な方法も提供する。例えば、この方法は、カフェイン23、デヒドロコール酸24、および様々な抗酸化剤および抗凝固剤25,26の治療効果の検証を可能にした。この証拠は、TC誘導SAPモデルの汎用性を示しています。Wittelらは同様のマウスモデル27を記述したが、実装手順の詳細が欠けていると、所見を再現できなくなる可能性がある。この記事では、単純な自家製マイクロシリンジを使用する方法に焦点を当て、TC誘発SAPを研究することで、APの病因と治療のさらなる研究だけでなく、他の多くの物質に完全に適応可能な実験方法についても可能なガイダンスを提供します。
Protocol
Representative Results
Discussion
TC によって誘導される SAP モデルは、優れた研究ツールです。この研究で示したように、このモデルは、特定のデバイスを使用することなく、一般的なラボで非常に簡単に実現できます。組織学および生化学的分析と組み合わせて使用すると、APを誘導および評価するためのコスト(安価な試薬)および時間節約(24時間時間窓)アプローチを提供する。 TCの濃度を調整することは、軽…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NCRCHのトランスレーショナルリサーチ助成金[2020WSA01]、蘇州健康委員会からのKJXW科学助成金[KJXW2020002]、蘇州市の科学技術計画(SKY2021038およびSKJY2021050)、江蘇省高等教育機関の優先学術プログラム開発(PAPD)からの助成金、江蘇省の一次研究および社会開発計画(BE2018659)からの支援に感謝しています。
Materials
| 0.5% iodophor | Shanghai Likang Disinfectant | 310102 | 4 mL/mouse |
| 0.9% sodium chloride | Sinopharm Group Co., Ltd. | 10019318 | 0.8 mL/mouse |
| 1% Pentobarbital sodium | Sigma | P3761 | 0.2 -0.25 mL/mouse |
| 25 μL flat tip Microliter syringe | Gaoge, Shanghai | A124019 | |
| 4% Paraformaldehyde | Beyotime, Nantong, China | P0099-500ml | |
| 5% sodium taurocholate (TC) | Aladdin | S100834-5g | 10 μL/SAP mouse |
| 6-0 Sterile nylon microsuture with threaded needle (1/2 circle) | Cheng-He | 20093 | |
| 75% alcohol | Sinopharm Group Co., Ltd. | 10009218 | 4 mL/mouse |
| 8-0 Sterile nylon microsuture with threaded needle (3/8 circle) | Cheng-He | 19064 | |
| ALT Activity Assay Kit | EPNK, Anhui, China | ALT0012 | |
| Amylase Assay Kit | EPNK, Anhui, China | AMY0012 | |
| Angled small bulldog clamp with 12 mm jaw (3 cm) | Cheng-He | HC-X022 | |
| aspen shavings or shreds for mouse bedding | Beijing Vital River Laboratory Animal Technology | VR03015 | |
| AST Activity Assay Kit | EPNK, Anhui, China | AST0012 | |
| Blood Urea Nitrogen (BUN) Assay Kit | EPNK, Anhui, China | BUN0011 | |
| C57BL/6 mouse | Beijing Vital River Laboratory Animal Technology | 213 | |
| Creatine Assay Kit | EPNK, Anhui, China | CRE0012 | |
| Feature microtome blade | Beyotime, Nantong, China | E0994 | |
| Hemostatic Forceps (9.5 cm, Curved) | JZ, Shanghai Medical Instruments Co. Ltd. | JC3901 | |
| Lipase Assay Kit | Jiancheng, Nanjing, China | A054-2-1 | |
| Microtome | Leica biosystem, Germany | RM2245 | |
| Mindray biochemistry analyzer | Mindray, Shenzhen, China | BS-420 | |
| MPO Assay Kit | Jiancheng, Nanjing, China | A044-1-1 | |
| Normal mouse chow | Trophic, Nantong, China | LAD 1000 | |
| Phosphate buffered saline | Beyotime, Nantong, China | C0221A | |
| Straight micro-bulldog clamp with 5 mm jaw (1.5 cm) | JZ, Shanghai Medical Instruments Co. Ltd. | W40130 | |
| Straight or curved forceps (11.0 cm) | Cheng-He | HC-X091A or HC-X090A | |
| Straight Scissors (10.0 cm) | Cheng-He, Ningbo, China | HC-J039102 | |
| Thermo Scientific Centrifuge | Thermo Scientific, USA | Multifuge X1R |
References
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