В этом исследовании представлен протокол иммуноцитохимии живых 3D-клеток, применяемый к детской диффузной срединной клеточной линии глиомы, полезный для изучения в режиме реального времени экспрессии белков на плазматической мембране во время динамических процессов, таких как инвазия и миграция 3D-клеток.
Миграция и инвазия клеток являются специфическими признаками диффузной срединной глиомы (DMG) H3K27M-мутантных опухолей. Мы уже смоделировали эти особенности с помощью трехмерного (3D) клеточного анализа инвазии и миграции. В этом исследовании мы оптимизировали эти 3D-анализы для иммунохимии живых клеток. Реагент для мечения антител был использован для обнаружения в режиме реального времени экспрессии молекулы адгезии CD44 на плазматической мембране мигрирующих и вторгающихся клеток первичной клеточной линии DMG H3K27M, полученной от пациентов. CD44 связан с фенотипом раковых стволовых клеток, миграцией и инвазией опухолевых клеток и участвует в прямом взаимодействии с внеклеточным матриксом центральной нервной системы (ЦНС). Нейросферы (НС) из клеточной линии DMG H3K27M встраивали в матрицу базальной мембраны (BMM) или помещали на тонкий слой покрытия BMM в присутствии антитела к CD44 в сочетании с реагентом для мечения антител (ALR). Иммуноцитохимический анализ живых 3D-клеток проводили на приборе для анализа живых клеток для количественного измерения общей экспрессии CD44, в частности, мигрирующих и вторгающихся клеток. Метод также позволяет визуализировать в режиме реального времени прерывистую экспрессию CD44 на плазматической мембране мигрирующих и инвирующих клеток. Кроме того, анализ также позволил по-новому взглянуть на потенциальную роль CD44 в мезенхимальном переходе в амебоидный в клетках DMG H3K27M.
Способность опухолевых клеток уклоняться и распространяться через окружающие ткани является отличительной чертой рака1. В частности, подвижность опухолевых клеток является характерной чертой злокачественных опухолей, будь то метастатический тип опухоли, такой как рак молочной железы 2 или колоректальныйрак 3, или местноинвазивный тип, такой как диффузная глиома 4,5.
Визуализация играет центральную роль в исследовании многих аспектов фенотипов опухолевых клеток; Тем не менее, визуализация живых клеток, безусловно, предпочтительна при изучении динамических клеточных процессов, таких как миграция и инвазия, когда происходят изменения в морфологии и межклеточном взаимодействии 6,7 и могут быть легче изучены с течением времени. Для визуализации живых клеток могут использоваться различные системы оптической микроскопии, от фазово-контрастных до конфокальных флуоресцентных микроскопов, и получение изображений выполняется в течение короткого или длительного периода времени на инвертированном микроскопе, оснащенном камерой для контроля температуры иCO2, или в системах анализа изображений с высоким содержанием изображения, которые имеют встроенные камеры, или, в качестве альтернативы, в системах изображений, которые могут находиться в инкубаторе без необходимости тревожить клетки в течение всего времени эксперимента. Выбор используемой системы часто продиктован рядом факторов, таких как необходимое разрешение, продолжительность общего времени сбора данных и временные интервалы, тип используемого сосуда и пропускная способность анализа (однокамерная или многолуночная планшет), чувствительность используемых клеток (драгоценные и/или редкие клетки) и фототоксичность клеток при наличии флуорофоров.
Что касается флуоресцентной визуализации в режиме реального времени, то это может быть достигнуто путем трансдукции клеток для экспрессии флуоресцентных белков либо для стабильной экспрессии, либо в качестве индуцируемой системы8, путем транзиторной клеточной трансфекции или с помощью клеточных красителей, которые в настоящее время доступны для мечения живых клеток7, для отслеживания живых клеток, а также для мечения субклеточных органелл9.
Недавно был разработан полезный подход для иммуноцитохимии живых клеток, при котором антитело, распознающее поверхностный маркер выбора, может быть связано с реагентом для мечения, а при добавлении питательной среды клетки, экспрессирующие специфический маркер, могут быть легко визуализированы в режиме реального времени с помощью визуализации живых клеток. Визуализация и количественная оценка экспрессии маркеров с помощью такой системы могут быть легко достигнуты при выращивании клеток в двумерных (2D) условиях культивирования10.
В этом исследовании мы оптимизировали протоколы для инвазии и миграции клеток диффузной срединной глиомы (DMG) у детей11,12. DMG являются высокоагрессивными опухолями головного мозга, поражающими детей, в подавляющем большинстве случаев связанными с драйверной мутацией K27M в вариантах гистонов H3. ДМГ возникают в стволе головного мозга и срединных отделах центральной нервной системы (ЦНС) и характеризуются высокой инфильтративной природой. Было показано, что эта инвазивная способность, по крайней мере частично, опосредована внутриопухолевой гетерогенностью и ракоподобными особенностями стволовых клеток DMG7.
В качестве примера для наших анализов использовали реагент для мечения антител (ALR) в комбинации с антителами к CD44. CD44 представляет собой трансмембранный гликопротеин и молекулу адгезии, экспрессируемую на стволовых клетках и других типах клеток, связанную с фенотипом раковых стволовых клеток, миграцией и инвазией опухолевых клеток13. Протоколы включают в себя подготовку образца, получение изображения в светлопольном и флуоресцентном режиме, а также анализ на приборе для анализа живых клеток, который позволил количественно измерить в режиме реального времени общую экспрессию CD44 на клеточной мембране DMG во время 3D-инвазии и миграции. Анализы также позволили визуализировать прерывистый флуоресцентный сигнал CD44 на отдельных клетках во время миграции и вторжения. Интересно, что также наблюдался эффект антитела к CD44, который, потенциально действуя как блокирующее антитело, также, по-видимому, уменьшал миграцию и инвазию клеток, а также индуцировал переключение паттерна инвазии с коллективного мезенхимоподобного на более одноклеточный амебоидный фенотип.
Иммуноцитохимия живых 3D-клеток, которую мы применили для инвазии и миграции DMG у детей, может быть легко адаптирована и для других высокоинвазивных типов опухолевых клеток, включая клеточные линии рака молочной железы и толстой кишки.
В отличие от ранее выполненных имму?…
The authors have nothing to disclose.
Мы хотели бы поблагодарить д-ра Сильвию Содду и д-ра Джулию Федеричи (Отдел сотовых сетей и молекулярных терапевтических мишеней, Национальный институт рака IRCCS-Regina Helen, Рим, Италия) за доступ к системе визуализации живых клеток IncuCyte S3 в предварительной настройке протокола визуализации. Кроме того, мы благодарим Бернадетт Коложсвари за технические консультации. Исследование было поддержано грантом Children with Cancer UK (16-234) и Министерством здравоохранения Италии Ricerca Corrente. М. Винчи является стипендиатом программы «Дети с раком» в Великобритании. Р. Ферретти является стипендиатом Фонда Веронези (2018 и 2019). Авторы выражают благодарность Fondazione Heal за поддержку и Фонду детской больницы за финансирование Банка детских опухолей Квинсленда.
96 Well TC-Treated Microplates | Corning | 3595 | size 96 wells, polystyrene plate, flat bottom |
Accutase | Euroclone | ECB3056D | solution for neurosphere dissociation |
Burker chamber | Mv medical | FFL16034 | cell counting chamber |
CD-44 (156-3C11) | Cell Signaling Technology | 3570 | Mouse mAb IgG2a |
Corning Matrigel Matrix | Corning | 356237 | Basement Membrane Matrix (BMM), Phenol Red-free, LDEV-free |
Fabfluor-488 Antibody Labeling Dye | Incucyte | 4743 | Antibody labelling reagent (ALR): Mouse IgG2a 488 antibody for Live-Cell Immunocytochemistry |
Incucyte S3 and/or SX5 Live-Cell Analysis Instrument | Sartorius | – | The Incucyte S3 and/or SX5 Instrument is used for real-time cell monitoring and surveillance, cell health and viability, migration and invasion, plus a wide range of phenotypic cell-based assays. |
Inverted Microscope | – | any inverted microscope | |
Opti-Green Background Suppressor Reagent | Incucyte | 6500-0045 | Backgroung suppressor reagent (BSR) |
Tumor stem cell (TSM) medium | – | – | growth cell medium (see reference in the text for details) |
Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate | Corning Costar | 7007 | size 96 well, round bottom clear |