소아 미만성 정중선 신경아교종의 Live-3D-Cell Immunocytochemistry Assays
Summary
이 연구는 소아 미만성 정중선 신경아교종 세포주에 적용되는 생3D 세포 면역세포화학 프로토콜을 제시하며, 3D 세포 침습 및 이동과 같은 동적 과정에서 원형질막에서 단백질의 발현을 실시간으로 연구하는 데 유용합니다.
Abstract
세포 이동 및 침습은 미만성 정중선 신경아교종(DMG) H3K27M 돌연변이 종양의 특정 특징입니다. 우리는 이미 3차원(3D) 세포 기반 침입 및 이동 분석을 사용하여 이러한 특징을 모델링했습니다. 이 연구에서 우리는 생세포 면역세포화학을 위해 이러한 3D 분석을 최적화했습니다. 항체 라벨링 시약을 사용하여 DMG H3K27M 일차 환자 유래 세포주의 이동 및 침입 세포의 원형질막에서 접착 분자 CD44의 발현을 실시간으로 검출했습니다. CD44는 암 줄기 세포 표현형 및 종양 세포 이동 및 침윤과 관련이 있으며 중추신경계(CNS) 세포외 기질과의 직접적인 상호작용에 관여합니다. DMG H3K27M 세포주의 신경구(NS)를 항체 표지 시약(ALR)과 함께 항-CD44 항체의 존재 하에 기저막 매트릭스(BMM)에 매립하거나 BMM의 얇은 코팅층 위에 놓았습니다. 전체 CD44 발현, 특히 이동 및 침입 세포에 대한 정량적 측정을 위해 생세포 분석 장비에서 생-3D 세포 면역세포화학 이미지 분석을 수행하였다. 이 방법은 또한 이동 및 침입 세포의 원형질막에서 CD44의 간헐적 발현을 실시간으로 시각화 할 수 있습니다. 또한, 이 분석은 DMG H3K27M 세포의 중간엽에서 아메보이드로의 전이에서 CD44의 잠재적 역할에 대한 새로운 통찰력을 제공했습니다.
Introduction
종양 세포가 주변 조직을 통해 회피하고 전파하는 능력은 암의 특징입니다1. 특히, 종양 세포 운동성은 유방2 또는 결장직장암3과 같은 전이성 종양 유형이든 미만성 신경교종과 같은 국소 침습성 유형이든 악성 종양의 특징입니다 4,5.
이미징은 종양 세포 표현형의 여러 측면을 조사하는 데 중심적인 역할을 합니다. 그러나, 생세포 이미징은 형태 및 세포-세포 상호작용 6,7의 변화가 발생하고 시간이 지남에 따라 더 쉽게 검사될 수 있는 이동 및 침입과 같은 동적 세포 과정을 연구할 때 확실히 선호됩니다. 라이브 셀 이미징의 경우, 위상차에서 컨포칼 형광 현미경에 이르기까지 다양한 광학 현미경 시스템을 사용할 수 있으며, 온도 및CO2 제어를 위한 챔버가 장착된 도립 현미경에서 단기간 또는 장기간에 걸쳐 이미지 획득을 수행하거나, 챔버가 내장된 고함량 이미지 분석 시스템에서, 또는 전체 기간 동안 세포를 교란할 필요 없이 인큐베이터에 앉을 수 있는 이미지 시스템에서 수행할 수 있습니다 실험의. 사용되는 시스템의 선택은 필요한 분해능, 전체 획득 시간 및 시간 간격의 길이, 사용된 용기 유형 및 분석 처리량(단일 챔버 또는 다중 웰 플레이트), 사용된 세포의 민감도(귀중한 세포/또는 희귀 세포) 및 형광단이 존재하는 경우 세포의 광독성과 같은 여러 요인에 의해 결정되는 경우가 많습니다.
라이브 모드에서의 형광 이미징과 관련하여, 이는 안정적인 발현을 위해 또는 유도성 시스템(inducible system)8으로서 형광 단백질의 발현을 위해 세포를 형질도입하거나, 일시적인 세포 형질감염에 의해, 또는 현재 생세포 표지(live-cell labeling)7, 생세포 추적(live-cell tracking) 및 세포내 소기관(subcellular organelles)9의 표지에 사용할 수 있는 세포 염료를 사용함으로써 달성될 수 있다.
최근 생세포 면역세포화학을 위한 유용한 접근법이 개발되었는데, 여기서 선택한 표면 마커를 인식하는 항체를 라벨링 시약에 결합할 수 있으며, 배양 배지에 추가하면 특정 마커를 발현하는 세포를 생세포 이미징을 통해 실시간으로 쉽게 이미징할 수 있습니다. 이러한 시스템을 이용한 마커 발현의 시각화 및 정량화는 세포가 2차원(2D) 배양 조건(10)에서 성장할 때 용이하게 달성될 수 있다.
이 연구에서 우리는 소아 미만성 정중선 신경아교종(DMG) 환자 유래 세포의 생3D 세포 면역세포화학 침습 및 이동에 대한 프로토콜을 최적화했습니다11,12. DMG는 어린이에게 영향을 미치는 매우 공격적인 뇌종양으로, 대다수는 히스톤 H3 변이체의 드라이버 돌연변이 K27M과 관련이 있습니다. DMG는 뇌간과 중추신경계(CNS)의 정중선 영역에서 발생하며 침윤성이 높은 특성이 특징입니다. 이러한 침습 능력은 DMG 세포의 종양 내 이질성 및 암 줄기 유사 특징에 의해 적어도 부분적으로 매개되는 것으로 나타났다7.
우리의 분석을 예시하기 위해 항체 표지 시약(ALR)을 CD44에 대한 항체와 함께 사용했습니다. CD44는 암 줄기 세포 표현형 및 종양 세포 이동 및 침습과 관련된 줄기 세포 및 기타 세포 유형에서 발현되는 막횡단 당단백질 및 부착 분자이다13. 프로토콜에는 샘플 준비, 명시야 및 형광 모드에서의 이미지 획득, 3D 침습 및 이동 중에 DMG 세포막에서 전체 CD44 발현을 실시간으로 정량적으로 측정할 수 있는 생세포 분석 기기에서의 분석이 포함됩니다. 이 분석은 또한 이동 및 침입하는 동안 개별 세포에서 CD44의 간헐적 형광 신호를 시각화할 수 있는 가능성을 허용했습니다. 흥미롭게도 잠재적으로 차단 항체로 작용하는 항-CD44 항체의 효과도 관찰되었으며, 세포 이동 및 침습을 감소시킬 뿐만 아니라 집단 중간엽 유사에서 보다 단일 세포 아메보이드 유사 표현형으로 침입 패턴의 전환을 유도하는 것으로 보였습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
소아 DMG 침습 및 이동을 위해 여기에서 채택한 생3D 세포 면역세포화학은 유방암 및 결장암 세포주를 포함한 다른 고침습성 종양 세포 유형에도 쉽게 적용할 수 있습니다.
이전에 수행된 생-2D-세포 면역세포화학 분석법(live-2D-cell immunocytochemistry assay)10과 달리, 3D로 작업할 때, 몇 가지 중요한 단계에 주의를 기울이는 것이 좋다. 특히, 우리가 설명하는 침습 분…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이미징 프로토콜의 예비 설정에서 IncuCyte S3 라이브 셀 이미징 시스템에 액세스해 주신 Silvia Soddu 박사와 Giulia Federici 박사(IRCCS-Regina Elena National Cancer Institute, 이탈리아 로마의 세포 네트워크 및 분자 치료 표적 단위)에게 감사드립니다. 또한 기술적인 조언을 해주신 Bernadett Kolozsvari에게 감사드립니다. 이 연구는 Children with Cancer UK 보조금 (16-234)과 이탈리아 보건부 Ricerca Corrente의 지원을 받았습니다. M Vinci는 Children with Cancer UK Fellow입니다. R Ferretti는 Fondazione Veronesi Fellowship (2018 및 2019)의 수혜자입니다. 저자는 Fondazione Heal의 지원과 Queensland Children’s Tumor Bank에 자금을 지원한 Children’s Hospital Foundation에 감사를 표합니다.
Materials
| 96 Well TC-Treated Microplates | Corning | 3595 | size 96 wells, polystyrene plate, flat bottom |
| Accutase | Euroclone | ECB3056D | solution for neurosphere dissociation |
| Burker chamber | Mv medical | FFL16034 | cell counting chamber |
| CD-44 (156-3C11) | Cell Signaling Technology | 3570 | Mouse mAb IgG2a |
| Corning Matrigel Matrix | Corning | 356237 | Basement Membrane Matrix (BMM), Phenol Red-free, LDEV-free |
| Fabfluor-488 Antibody Labeling Dye | Incucyte | 4743 | Antibody labelling reagent (ALR): Mouse IgG2a 488 antibody for Live-Cell Immunocytochemistry |
| Incucyte S3 and/or SX5 Live-Cell Analysis Instrument | Sartorius | – | The Incucyte S3 and/or SX5 Instrument is used for real-time cell monitoring and surveillance, cell health and viability, migration and invasion, plus a wide range of phenotypic cell-based assays. |
| Inverted Microscope | – | any inverted microscope | |
| Opti-Green Background Suppressor Reagent | Incucyte | 6500-0045 | Backgroung suppressor reagent (BSR) |
| Tumor stem cell (TSM) medium | – | – | growth cell medium (see reference in the text for details) |
| Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate | Corning Costar | 7007 | size 96 well, round bottom clear |
References
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Weigelt, B., Peterse, J. L., van’t Veer, L. J. Breast cancer metastasis: markers and models. Nature Reviews Cancer. 5 (8), 591-602 (2005).
- Magrì, A., Bardelli, A. Does early metastatic seeding occur in colorectal cancer. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 16 (11), 651-653 (2019).
- Cuddapah, V. A., Robel, S., Watkins, S., Sontheimer, H. A neurocentric perspective on glioma invasion. Nature Reviews Neuroscience. 15 (7), 455-465 (2014).
- Caretti, V., et al. Subventricular spread of diffuse intrinsic pontine glioma. Acta Neuropathologica. 128 (4), 605-607 (2014).
- Pericoli, G., et al. Integration of multiple platforms for the analysis of multifluorescent marking technology applied to pediatric GBM and DIPG. International Journal of Molecular Sciences. 21 (18), 6763 (2020).
- Vinci, M., et al. Functional diversity and cooperativity between subclonal populations of pediatric glioblastoma and diffuse intrinsic pontine glioma cells. Nature Medicine. 24 (8), 1204-1215 (2018).
- Shuen, W. H., Kan, R., Yu, Z., Lung, H. L., Lung, M. L. Novel lentiviral-inducible transgene expression systems and versatile single-plasmid reporters for in vitro and in vivo cancer biology studies. Cancer Gene Therapy. 22 (4), 207-214 (2015).
- Huang, C. C., et al. Autophagy-regulated ROS from xanthine oxidase acts as an early effector for triggering late mitochondria-dependent apoptosis in cathepsin s-targeted tumor cells. PLoS One. 10 (6), 0128045 (2015).
- Prudner, B. C., et al. Arginine starvation and docetaxel induce c-Myc-driven hENT1 surface expression to overcome gemcitabine resistance in ASS1-negative tumors. Clinical Cancer Research. 25 (16), 5122-5134 (2019).
- Ferretti, R., et al. Tumor cell invasion into Matrigel: optimized protocol for RNA extraction. Biotechniques. 70 (6), 327-335 (2021).
- Vinci, M., Box, C., Eccles, S. A. Three-dimensional (3D) tumor spheroid invasion assay. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (99), e52686 (2015).
- Chen, C., Zhao, S., Karnad, A., Freeman, J. W. The biology and role of CD44 in cancer progression: therapeutic implications. Journal of Hematology & Oncology. 11 (1), 64 (2018).
- Vinci, M., Box, C., Zimmermann, M., Eccles, S. A. Tumor spheroid-based migration assays for evaluation of therapeutic agents. Methods in Molecular Biology. 986, 253-266 (2013).
- Taylor, K. R., et al. Recurrent activating ACVR1 mutations in diffuse intrinsic pontine glioma. Nature Genetics. 46 (5), 457-461 (2014).
- Mount, C. W., et al. Potent antitumor efficacy of anti-GD2 CAR T cells in H3-K27M. Nature Medicine. 24 (5), 572-579 (2018).
- Louis, D. N., et al. The 2016 World Health Organization classification of tumors of the central nervous system: A summary. Acta Neuropathologica. 131 (6), 803-820 (2016).
- Czabanka, M., et al. Junctional adhesion molecule-C mediates the recruitment of embryonic-endothelial progenitor cells to the perivascular niche during tumor angiogenesis. International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 1209 (2020).
- Pardoll, D. M. The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy. Nature Reviews Cancer. 12 (4), 252-264 (2012).
- Panková, K., Rösel, D., Novotný, M., Brábek, J. The molecular mechanisms of transition between mesenchymal and amoeboid invasiveness in tumor cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 67 (1), 63-71 (2010).
- Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).
