小儿弥漫性中线胶质瘤的活-3D细胞免疫细胞化学测定
Summary
本研究提出了一种应用于儿科弥漫性中线胶质瘤细胞系的活 3D 细胞免疫细胞化学方案，有助于实时研究 3D 细胞侵袭和迁移等动态过程中质膜上蛋白质的表达。
Abstract
细胞迁移和侵袭是弥漫性中线胶质瘤（DMG）H3K27M突变肿瘤的特定标志。我们已经使用基于细胞的三维（3D）侵袭和迁移测定对这些特征进行了建模。在这项研究中，我们优化了这些用于活细胞免疫细胞化学的3D测定。抗体标记试剂用于实时检测粘附分子CD44在DMG H3K27M原代患者来源细胞系的迁移和侵袭细胞质膜上的表达。CD44与癌症干细胞表型和肿瘤细胞迁移和侵袭有关，并参与与中枢神经系统（CNS）细胞外基质的直接相互作用。在抗CD44抗体与抗体标记试剂（ALR）存在下，将来自DMG H3K27M细胞系的神经球（NS）嵌入基底膜基质（BMM）或置于BMM的薄涂层上。在活细胞分析仪器上进行活3D细胞免疫细胞化学图像分析，以定量测量整体CD44表达，特别是在迁移和入侵细胞上。该方法还允许实时可视化CD44在迁移和入侵细胞质膜上的间歇表达。此外，该测定还为CD44在DMG H3K27M细胞中间充质到变形虫转变的潜在作用提供了新的见解。
Introduction
肿瘤细胞逃避和通过周围组织传播的能力是癌症的标志1。特别是，肿瘤细胞运动是恶性肿瘤的特征，无论是转移性肿瘤类型如乳腺癌2或结直肠癌3，还是局部侵袭性类型如弥漫性胶质瘤4,5。
成像在肿瘤细胞表型的许多方面研究中具有核心作用;然而，在研究动态细胞过程（例如迁移和侵袭）时，当形态和细胞间相互作用发生变化时，活细胞成像绝对是首选 6,7 并且随着时间的推移可以更容易地检查。对于活细胞成像，可以使用不同的光学显微镜系统，从相衬到共聚焦荧光显微镜，并在配备温度和CO2控制室的倒置显微镜上进行短时间或长时间的图像采集，或在具有内置腔室的高内涵图像分析系统中，或者可以在可以坐在培养箱中的图像系统中，而无需在整个过程中干扰细胞的实验。所用系统的选择通常取决于许多因素，例如所需的分辨率、总采集时间和时间间隔的长度、使用的容器类型和测定的通量（单室或多孔板）、所用细胞（珍贵和/或稀有细胞）的灵敏度以及细胞的光毒性（如果存在荧光团）。
关于活模式下的荧光成像，这可以通过转导细胞以表达荧光蛋白来实现，无论是为了稳定表达还是作为诱导系统8，通过瞬时细胞转染，或者通过使用现在可用于活细胞标记7的细胞染料，用于活细胞跟踪以及标记亚细胞器9。
最近开发了一种用于活细胞免疫细胞化学的有用方法，其中识别所选表面标志物的抗体可以与标记试剂结合，并且在加入培养基后，表达特定标志物的细胞可以很容易地通过活细胞成像实时成像。当细胞在二维（2D）培养条件下生长时，使用这种系统可以轻松实现标记表达的可视化和定量10。
在这项研究中，我们优化了小儿弥漫性中线胶质瘤（DMG）患者来源细胞的活3D细胞免疫细胞化学侵袭和迁移的方案11,12。DMG是影响儿童的高度侵袭性脑肿瘤，绝大多数与组蛋白H3变体中的驱动突变K27M有关。DMG起源于脑干和中枢神经系统（CNS）的中线区域，其特征是高度浸润。这种侵入性能力已被证明至少部分是由肿瘤内异质性和DMG细胞的癌症干细胞样特征介导的7。
为了举例说明我们的检测方法，将抗体标记试剂（ALR）与CD44抗体结合使用。CD44是一种跨膜糖蛋白和粘附分子，在干细胞和其他细胞类型上表达，与癌症干细胞表型和肿瘤细胞迁移和侵袭有关13。这些协议包括样品制备、明场和荧光模式下的图像采集以及在活细胞分析仪器上的分析，该仪器允许在 3D 侵袭和迁移过程中实时定量测量 DMG 细胞膜上的整体 CD44 表达。这些测定还允许在迁移和入侵时可视化单个细胞上CD44的间歇荧光信号。有趣的是，还观察到抗CD44抗体的作用，其可能充当阻断抗体，似乎也减少了细胞迁移和侵袭，并诱导侵袭模式从集体间充质样转变为更单细胞的变形虫样表型。
Protocol
Representative Results
Discussion
我们在这里采用的用于儿科DMG侵袭和迁移的活3D细胞免疫细胞化学也可以很容易地适应其他高度侵袭的肿瘤细胞类型，包括乳腺癌和结肠癌细胞系。
与以前进行的活2D细胞免疫细胞化学测定10不同，在3D中工作时，建议注意一些关键步骤。特别是，对于我们描述的侵袭测定，建议在添加BMM之前，将ALR /抗体混合物直接添加到每个孔中具有NS的培养基中，而不是?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们要感谢Silvia Soddu博士和Giulia Federici博士（意大利罗马IRCCS-Regina Elena国家癌症研究所细胞网络和分子治疗靶点部门）在成像协议的初步设置中使用IncuCyte S3活细胞成像系统。此外，我们感谢Bernadett Kolozsvari的技术建议。该研究得到了英国癌症儿童拨款（16-234）和意大利卫生部Ricerca Corrente的支持。M Vinci是英国癌症儿童研究员。R Ferretti是Veronesi基金会奖学金（2018年和2019年）的获得者。作者感谢Fondazione Heal的支持，并感谢儿童医院基金会为昆士兰儿童肿瘤银行提供资金。
Materials
| 96 Well TC-Treated Microplates | Corning | 3595 | size 96 wells, polystyrene plate, flat bottom |
| Accutase | Euroclone | ECB3056D | solution for neurosphere dissociation |
| Burker chamber | Mv medical | FFL16034 | cell counting chamber |
| CD-44 (156-3C11) | Cell Signaling Technology | 3570 | Mouse mAb IgG2a |
| Corning Matrigel Matrix | Corning | 356237 | Basement Membrane Matrix (BMM), Phenol Red-free, LDEV-free |
| Fabfluor-488 Antibody Labeling Dye | Incucyte | 4743 | Antibody labelling reagent (ALR): Mouse IgG2a 488 antibody for Live-Cell Immunocytochemistry |
| Incucyte S3 and/or SX5 Live-Cell Analysis Instrument | Sartorius | – | The Incucyte S3 and/or SX5 Instrument is used for real-time cell monitoring and surveillance, cell health and viability, migration and invasion, plus a wide range of phenotypic cell-based assays. |
| Inverted Microscope | – | any inverted microscope | |
| Opti-Green Background Suppressor Reagent | Incucyte | 6500-0045 | Backgroung suppressor reagent (BSR) |
| Tumor stem cell (TSM) medium | – | – | growth cell medium (see reference in the text for details) |
| Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate | Corning Costar | 7007 | size 96 well, round bottom clear |
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