Культура и визуализация органоидов эпителия носа человека
Summary
Здесь представлен подробный протокол для описания органоидной модели in vitro из эпителиальных клеток носа человека. Протокол имеет опции для измерений, требующих стандартного лабораторного оборудования, с дополнительными возможностями для специализированного оборудования и программного обеспечения.
Abstract
Индивидуализированная терапия для пациентов с муковисцидозом (МВ) может быть достигнута с помощью модели заболевания in vitro для понимания исходной активности регулятора трансмембранной проводимости муковисцидоза (CFTR) и восстановления из низкомолекулярных соединений. Наша группа недавно сосредоточилась на создании хорошо дифференцированной органоидной модели, непосредственно полученной из первичных эпителиальных клеток носа человека (HNE). Гистология секционированных органоидов, полноразмерное иммунофлуоресцентное окрашивание и визуализация (с использованием конфокальной микроскопии, иммунофлуоресцентной микроскопии и яркого поля) необходимы для характеристики органоидов и подтверждения эпителиальной дифференцировки при подготовке к функциональным анализам. Кроме того, органоиды HNE производят просветы различных размеров, которые коррелируют с активностью CFTR, различая органоиды CF и без CF. В данной рукописи подробно описана методология культивирования органоидов HNE с акцентом на оценку дифференциации с использованием методов визуализации, включая измерение исходной площади просвета (метод измерения активности CFTR в органоидах, который может использовать любая лаборатория с микроскопом), а также разработанный автоматизированный подход к функциональному анализу (который требует более специализированного оборудования).
Introduction
Введение в технику
Анализы ex vivo на основе культуры являются все более используемым инструментом для точной медицины и изучения патофизиологии заболеваний. Первичная культура клеток эпителия носа человека (HNE) использовалась в многочисленных исследованиях муковисцидоза 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 , аутосомно-рецессивное заболевание, которое влияет на функцию эпителиальных клеток в нескольких органах. Культура HNE обеспечивает возобновляемый источник эпителия дыхательных путей, который может быть получен перспективно и воспроизводит электрофизиологические и биохимические качества для проверки активности регулятора трансмембранной проводимости муковисцидоза (CFTR). Клетки HNE могут быть отобраны с минимальными побочными эффектами14, аналогичными обычным вирусным респираторным тампонам. Исследовательская работа, описывающая модель исследования муковисцидоза, полученная из биопсии щетки HNE, была недавно опубликована11,13. Подобно другим моделям, использующим первичную HNE 2,3 и кишечную ткань 15,16,17,18,19, подробная характеристика дифференцировки и визуализации этой модели описаны здесь для использования в исследованиях муковисцидоза и для оказания помощи в исследованиях других заболеваний дыхательных путей13 . Органоидная модель не является неограниченной, как увековеченные клеточные линии, но может быть расширена путем условного перепрограммирования (с использованием облученных и инактивированных фидерных фидерных фидеров и ингибиторов рокиназы) до более похожего на стволовые клетки состояния 20,21,22,23. Обработка биопсии щеток HNE с использованием этого метода дает большое количество эпителиальных клеток для использования в нескольких приложениях с более высокой пропускной способностью, сохраняя при этом способность к полной дифференцировке. Хотя этот протокол был разработан с использованием фидерных клеток, другие методологии могут быть использованы исследователями, желающими избежать технологии фидерных клеток14,24.
Важность методики для биологии легких
Значительное исследование было посвящено пониманию того, как отсутствие регулярного, функционирующего CFTR в клеточной мембране эпителиальных клеток приводит к дисфункции в легких, поджелудочной железе, печени, кишечнике или других тканях. Дисфункциональный транспорт ионов эпителия, особенно хлорида и бикарбоната, приводит к уменьшению объема эпителиальных выстилающих жидкостей и изменениям в слизистых выделениях, что приводит к застою и обструкции слизистой оболочки. При других заболеваниях дыхательных путей, таких как первичная цилиарная дискинезия, измененное цилиарное движение ухудшает слизистый клиренс и приводит к застою слизистой и обструкции25. Поэтому текущая органоидная модель HNE была разработана для различных применений, в зависимости от экспериментального дизайна и ресурсов исследователя. Это включает в себя визуализацию живых клеток с использованием пятен живых клеток; фиксация и сечение для характеристики морфологии; иммунофлуоресцентное окрашивание антителами и конфокальная визуализация цельного крепления во избежание нарушения внутрипросветных структур; и визуализация яркого поля и микрооптическая когерентная томография для количественных измерений частоты ресничного биения и мукоцилиарного транспорта13. Чтобы облегчить распространение на других исследователей, для культивирования использовались коммерчески доступные реагенты и расходные материалы. Был разработан функциональный анализ, в котором использовались общие методы микроскопа и более специализированное оборудование. В целом, хотя настоящая модель была разработана для оценки активности CFTR на исходном уровне или в ответ на терапию, методы, описанные в этом протоколе, могут быть применены к другим заболеваниям, связанным с функцией эпителиальных клеток, особенно к переносу эпителиальной клеточной жидкости.
Сравнение с другими методологиями
Недавно была разработана полезность этой органоидной модели путем корреляции in vitro CFTR модуляторных реакций органоидов пациентов с их клиническим ответом11. Примечательно, что также показано, что настоящая модель параллельна токам короткого замыкания, текущему золотому стандарту оценки функции CFTR, у тех же пациентов. Ток короткого замыкания отличается от анализа набухания, потому что первый измеряет функцию CFTR через транспорт ионов26. В отличие от этого, этот анализ измеряет более нисходящий эффект с переносом жидкости, предоставляя дополнительную информацию об общей функции CFTR 27,28,29,30,31,32. Измерения тока короткого замыкания по-прежнему являются распространенным и надежным методом определения активностиканала хлорида CFTR 1,33. Эти электрофизиологические анализы требуют специализированного, дорогостоящего оборудования, требуют во много раз больше клеток для каждой экспериментальной репликации, чем органоидный анализ, не могут быть легко автоматизированы и не поддаются масштабированию для приложений с более высокой пропускной способностью. Другая органоидная модель, полученная из кишечного эпителия, имеет дополнительные преимущества 15,16,17,18, такие как более отличная репликативная способность, но не получена из ткани дыхательных путей и не является универсально доступной. Щетки HNE получают недорогими цитологическими щетками без необходимости седации и с минимальным риском. Получение чистки зубов не требует клинициста и может быть выполнено обученными координаторами исследований и другим исследовательским персоналом14. Органоидная модель HNE может быть культивирована любой лабораторией с возможностями первичной клеточной культуры, и некоторые из применений могут быть выполнены стандартными методами микроскопии. В целом, эти преимущества обеспечивают дополнительный доступ к технологии оценки функции эпителия дыхательных путей, которая в противном случае могла бы быть недоступна для некоторых лабораторий. Кроме того, органоиды HNE могут быть использованы для изучения других болезненных состояний, которые влияют на дыхательные пути, таких как первичная цилиарная дискинезия25 или вирусная инфекция, которую кишечные органоиды не могут.
Protocol
Representative Results
Discussion
Эта рукопись содержит подробные методологии для всесторонней живой и фиксированной визуализации эпителиальных органоидов дыхательных путей, полученных из биопсии кисти HNE. Он описывает функциональные анализы, которые могут определить активность CFTR у человека. HNE обеспечивают минима?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы с благодарностью признаем вклад всех участников, которые пожертвовали биопсию щетки HNE для разработки этого протокола. Мы благодарим Латону Керш и сотрудников Детского исследовательского отдела за координацию набора добровольцев и сбор образцов. Мы благодарим Лили Денг, Джонатана Бейли и Стивена Маккея, бывших стажеров нашей лаборатории, за техническую помощь. Мы благодарим Чжун Лю и Жуй Чжао за их техническую помощь. Стивен М. Роу, директор Исследовательского центра CF в UAB, обеспечивает лидерство и ресурсы, без которых эта работа была бы невозможна. Мы также хотели бы поблагодарить Сару Гвадиану из Biotek за помощь в обучении инструментам, Роберта Грабски за помощь в конфокальной микроскопии в Центре визуализации высокого разрешения UAB и Дежи Ванга за гистологическую помощь в UAB Histology Core. Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения (NIH). Грант K23HL143167 (для JSG), Грант Фонда муковисцидоза (CFF) GUIMBE18A0-Q (для JSG), Центр муковисцидоза Грегори Флеминга Джеймса [гранты NIH R35HL135816 и DK072482 и Программа исследований и разработок CFF Университета Алабамы в Бирмингеме (UAB) (Rowe19RO)] и Центр клинических и трансляционных наук UAB (грант NIH UL1TR001417).
Materials
| Nasal brush | Medical Packaging CYB1 | CYB-1 | Length: 8 inches, width approximately 7 mm |
| Large-Orifice Pipette Tips | ThermoFisher Scientific | 02-707-141 | Large bore pipette tips |
| Accutase | ThermoFisher Scientific | A1110501 | Cell detachment solution |
| 0.05% trypsin -EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| Trypsin inhibitor from soybean | Sigma | T6522 | Working solution: 1mg/mL in 1XDPBS |
| Matrigel matrix | Corning | 356255 | Extracellular matrix (EM) |
| µ-Slide Angiogenesis | Ibidi | 81506 | 15-well slide |
| 24-Well Transwell | Corning | 7200154 | Culture insert |
| Chambered Coverglass | ThermoFisher Scientific | 155409 | 8-well glass-bottom chamber slides |
| Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive | ThermoFisher Scientific | 354240 | Cell adhesive |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 50980487 | |
| Triton X-100 | Alfa Aesar | A16046 | |
| BSA | ThermoFisher Scientific | BP1600-100 | |
| NucBlue | ThermoFisher Scientific | R37605 | DAPI |
| Eclipse Ts2-FL (Inverted Routine Microscope) | Nikon | Inverted epi-fluorescence microscope or bright-field microscope | |
| Nikon A1R-HD25 | Nikon | Confocal microscope | |
| NIS Elements- Basic Research | Nikon | manual imaging analysis software | |
| Histogel | ThermoFisher Scientific | HG-4000-012 | |
| Disposable Base Molds | ThermoFisher Scientific | 41-740 | |
| Lionheart FX | BioTek | BTLFX | Automated image system |
| Lionheart Cover | BioTek | BT1450009 | Environmental Control Lid |
| Humidity Chamber | BioTek | BT1450006 | Stage insert (environmental chamber) |
| Gas Controller for CO2 and O2 | BioTek | BT1210013 | Gas controller |
| Microplate/Slide Stage Insert | BioTek | BT1450527 | Slide holder |
| Gen5 Imaging Prime Software | BioTek | BTGEN5IPRIM | Automated imaging analysis software |
| 4x Phase Contrast Objective | BioTek | BT1320515 | |
| 10x Phase Contrast Objective | BioTek | BT1320516 | |
| LED Cube | BioTek | BT1225007 | |
| Filter Cube (DAPI) | BioTek | BT1225100 | DAPI |
| CFTRinh-172 | Selleck Chemicals | S7139 | |
| Forskolin | Sigma | F6886 | |
| IBMX | Sigma | I5879 | |
| Expansion Media | |||
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11965 | |
| F12 Nutrient mix | ThermoFisher Scientific | 11765 | |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher Scientific | 16140-071 | |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15-140-122 | |
| Cholera Toxin | Sigma | C8052 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | ThermoFisher Scientific | PHG0314 | |
| Hydrocortisone (HC) | Sigma | H0888 | |
| Insulin | Sigma | I9278 | |
| Adenine | Sigma | A2786 | |
| Y-27632 | Stemgent | 04-0012-02 | |
| Antibiotic Media | |||
| Ceftazidime | Alfa Aesar | J66460-03 | |
| Tobramycin | Alfa Aesar | J67340 | |
| Vancomycin | Alfa Aesar | J67251 | |
| Amphotericin B | Sigma | A2942 | |
| Differentiation Media | |||
| DMEM/F-12 (1:1) | ThermoFisher Scientific | 11330-32 | |
| Ultroser-G | Pall | 15950-017 | |
| Fetal Clone II | Hyclone | SH30066.03 | |
| Bovine Brain Extract | Lonza | CC-4098 | |
| Insulin | Sigma | I-9278 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H-0888 | |
| Triiodothyronine | Sigma | T-6397 | |
| Transferrin | Sigma | T-0665 | |
| Ethanolamine | Sigma | E-0135 | |
| Epinephrine | Sigma | E-4250 | |
| O-Phosphorylethanolamine | Sigma | P-0503 | |
| Retinoic Acid | Sigma | R-2625 | |
| Primary antibodies | |||
| Human CFTR antibody | R&D Systems | MAB1660 | Dilution: 100x |
| ZO-1 antibody | Thermo Fisher | MA3-39100-A647 | Dilution: 1000x |
| Anti-MUC5B antibody | Sigma | HPA008246 | Dilution: 100x |
| Anti-acetylated tubulin | Sigma | T7451 | Dilution: 100x |
| Anti-beta IV Tubulin antibody | Abcam | Ab11315 | Dilution: 100x |
| Secondary antibodies | |||
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21202 | Dilution: 2000x |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A21207 | Dilution: 2000x |
References
- Brewington, J. J., et al. Brushed nasal epithelial cells are a surrogate for bronchial epithelial CFTR studies. JCI Insight. 3 (13), (2018).
- Brewington, J. J., et al. Generation of human nasal epithelial cell spheroids for individualized cystic fibrosis transmembrane conductance regulator study. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57492 (2018).
- Brewington, J. J., et al. Detection of CFTR function and modulation in primary human nasal cell spheroids. Journal of Cystic Fibrosis. 17 (1), 26-33 (2017).
- Bridges, M. A., Walker, D. C., Davidson, A. G. Cystic fibrosis and control nasal epithelial cells harvested by a brushing procedure. In Vitro Cellular & Developmental Biology. 27 (9), 684-686 (1991).
- Bridges, M. A., Walker, D. C., Harris, R. A., Wilson, B. R., Davidson, A. G. Cultured human nasal epithelial multicellular spheroids: polar cyst-like model tissues. Biochemistry and Cell Biology. 69 (2-3), 102-108 (1991).
- Collie, G., Buchwald, M., Harper, P., Riordan, J. R. Culture of sweat gland epithelial cells from normal individuals and patients with cystic fibrosis. In Vitro Cellular & Developmental Biology. 21 (10), 597-602 (1985).
- Conger, B. T., et al. Comparison of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) and ciliary beat frequency activation by the CFTR Modulators Genistein, VRT-532, and UCCF-152 in primary sinonasal epithelial cultures. JAMA Otolaryngology-Head & Neck Surgery. 139 (8), 822-827 (2013).
- de Courcey, F., et al. Development of primary human nasal epithelial cell cultures for the study of cystic fibrosis pathophysiology. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 303 (11), 1173-1179 (2012).
- Gruenert, D. C., Basbaum, C. B., Widdicombe, J. H. Long-term culture of normal and cystic fibrosis epithelial cells grown under serum-free conditions. In Vitro Cellular & Developmental Biology. 26 (4), 411-418 (1990).
- Mosler, K., et al. Feasibility of nasal epithelial brushing for the study of airway epithelial functions in CF infants. Journal of Cystic Fibrosis. 7 (1), 44-53 (2008).
- Anderson, J. D., Liu, Z., Odom, L. V., Kersh, L., Guimbellot, J. S. CFTR function and clinical response to modulators parallel nasal epithelial organoid swelling. The American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 321 (1), 119-129 (2021).
- Guimbellot, J. S., et al. Nasospheroids permit measurements of CFTR-dependent fluid transport. JCI Insight. 2 (22), (2017).
- Liu, Z., et al. Human nasal epithelial organoids for therapeutic development in cystic fibrosis. Genes (Basel). 11 (6), (2020).
- Muller, L., Brighton, L. E., Carson, J. L., Fischer, W. A., Jaspers, I. Culturing of human nasal epithelial cells at the air liquid interface. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2013).
- Dekkers, J. F., vander Ent, C. K., Beekman, J. M. Novel opportunities for CFTR-targeting drug development using organoids. Rare Diseases. 1, 27112 (2013).
- Dekkers, J. F., et al. A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids. Nature Medicine. 19 (7), 939-945 (2013).
- Okiyoneda, T., et al. Mechanism-based corrector combination restores DeltaF508-CFTR folding and function. Nature Chemical Biology. 9 (7), 444-454 (2013).
- Schwank, G., et al. Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients. Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2013).
- Geurts, M. H., et al. CRISPR-based adenine editors correct nonsense mutations in a cystic fibrosis organoid biobank. Cell Stem Cell. 26 (4), 503-510 (2020).
- Bove, P. F., et al. Breaking the in vitro alveolar type II cell proliferation barrier while retaining ion transport properties. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 50 (4), 767-776 (2014).
- Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., McBride, A. A. Human keratinocytes are efficiently immortalized by a Rho kinase inhibitor. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2619-2626 (2010).
- Liu, X., et al. ROCK inhibitor and feeder cells induce the conditional reprogramming of epithelial cells. The American Journal of Pathology. 180 (2), 599-607 (2012).
- Palechor-Ceron, N., et al. Radiation induces diffusible feeder cell factor(s) that cooperate with ROCK inhibitor to conditionally reprogram and immortalize epithelial cells. The American Journal of Pathology. 183 (6), 1862-1870 (2013).
- Scudieri, P., et al. Ionocytes and CFTR chloride channel expression in normal and cystic fibrosis nasal and bronchial epithelial cells. Cells. 9 (9), (2020).
- Marthin, J. K., Stevens, E. M., Larsen, L. A., Christensen, S. T., Nielsen, K. G. Patient-specific three-dimensional explant spheroids derived from human nasal airway epithelium: a simple methodological approach for ex vivo studies of primary ciliary dyskinesia. Cilia. 6, 3 (2017).
- Blouquit, S., et al. Ion and fluid transport properties of small airways in cystic fibrosis. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 174 (3), 299-305 (2006).
- Birket, S. E., et al. Combination therapy with cystic fibrosis transmembrane conductance regulator modulators augment the airway functional microanatomy. The American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 310 (10), 928-939 (2016).
- Birket, S. E., et al. A functional anatomic defect of the cystic fibrosis airway. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 190 (4), 421-432 (2014).
- Chu, K. K., et al. Particle-tracking microrheology using micro-optical coherence tomography. Biophysical Journal. 111 (5), 1053-1063 (2016).
- Chu, K. K., et al. et al. In vivo imaging of airway cilia and mucus clearance with micro-optical coherence tomography. Biomedical Optics Express. 7 (7), 2494-2505 (2016).
- Liu, L., et al. Method for quantitative study of airway functional microanatomy using micro-optical coherence tomography. PLoS One. 8 (1), 54473 (2013).
- Tuggle, K. L., et al. Characterization of defects in ion transport and tissue development in cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-knockout rats. PLoS One. 9 (3), 91253 (2014).
- McCravy, M. S., et al. Personalised medicine for non-classic cystic fibrosis resulting from rare CFTR mutations. European Respiratory Journal. 56 (1), 2000062 (2020).
- Mutyam, V., et al. Therapeutic benefit observed with the CFTR potentiator, ivacaftor, in a CF patient homozygous for the W1282X CFTR nonsense mutation. Journal of Cystic Fibrosis. 16 (1), 24-29 (2017).
- Corning Inc. . CORNING CELL-TAK CELL AND TISSUE ADHESIVE. , (2013).
- Anderson, J. D., Liu, Z., Odom, L. V., Kersh, L., Guimbellot, J. S. CFTR function and clinical response to modulators parallel nasal epithelial organoid swelling. The American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 321 (1), 119-129 (2021).
- Biotek Instruments, Incorporated. . Lionheart FX Live Cell Imager Operator’s Manual. , (2016).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Simmonds, N. J. Is it cystic fibrosis? The challenges of diagnosing cystic fibrosis. Paediatric Respiratory Reviews. 31, 6-8 (2019).
- McGarry, M. E., et al. In vivo and in vitro ivacaftor response in cystic fibrosis patients with residual CFTR function: N-of-1 studies. Pediatric Pulmonology. 52 (4), 472-479 (2017).
- Garratt, L. W., et al. Determinants of culture success in an airway epithelium sampling program of young children with cystic fibrosis. Experimental Lung Research. 40 (9), 447-459 (2014).
