Culture et imagerie des organoïdes épithéliaux nasaux humains
Summary
Un protocole détaillé est présenté ici pour décrire un modèle organoïde in vitro à partir de cellules épithéliales nasales humaines. Le protocole propose des options pour les mesures nécessitant un équipement de laboratoire standard, avec des possibilités supplémentaires pour l’équipement et les logiciels spécialisés.
Abstract
Un traitement individualisé pour les patients atteints de mucoviscidose (FK) peut être réalisé avec un modèle de maladie in vitro pour comprendre l’activité de base du régulateur de conductance transmembranaire de la fibrose kystique (CFTR) et la restauration à partir de composés de petites molécules. Notre groupe s’est récemment concentré sur l’établissement d’un modèle organoïde bien différencié directement dérivé des cellules épithéliales nasales humaines primaires (HNE). L’histologie des organoïdes sectionnés, la coloration immunofluorescente à monture entière et l’imagerie (à l’aide de la microscopie confocale, de la microscopie immunofluorescente et du champ lumineux) sont essentielles pour caractériser les organoïdes et confirmer la différenciation épithéliale en préparation des essais fonctionnels. De plus, les organoïdes HNE produisent des lumens de différentes tailles qui sont en corrélation avec l’activité CFTR, en distinguant les organoïdes CF et non CF. Dans ce manuscrit, la méthodologie de culture des organoïdes HNE est décrite en détail, en se concentrant sur l’évaluation de la différenciation à l’aide des modalités d’imagerie, y compris la mesure de la zone lumineuse de base (une méthode de mesure de l’activité CFTR dans les organoïdes que tout laboratoire avec un microscope peut utiliser) ainsi que l’approche automatisée développée pour un test fonctionnel (qui nécessite un équipement plus spécialisé).
Introduction
Introduction à la technique
Les tests basés sur la culture ex vivo sont un outil de plus en plus utilisé pour la médecine de précision et l’étude de la physiopathologie des maladies. La culture épithéliale nasale humaine primaire (HNE) a été utilisée dans de nombreuses études sur la fibrose kystique 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 , une maladie autosomique récessive qui affecte la fonction des cellules épithéliales dans plusieurs organes. La culture HNE fournit une source renouvelable d’épithélium des voies respiratoires qui peut être obtenue prospectivement et récapitule les qualités électrophysiologiques et biochimiques pour tester l’activité du régulateur de conductance transmembranaire de la fibrose kystique (CFTR). Les cellules HNE peuvent être échantillonnées avec des effets secondaires minimes14, similaires aux écouvillons respiratoires viraux courants. Des travaux de recherche décrivant un modèle d’étude sur la fibrose kystique dérivé de biopsies à la brosse HNE ont été récemment publiés11,13. Bien que similaire à d’autres modèles utilisantl’HNE primaire 2,3 et le tissu intestinal 15,16,17,18,19, la caractérisation détaillée de la différenciation et de l’imagerie de ce modèle est décrite ici pour une utilisation dans la recherche sur la FK et pour aider aux études d’autres maladies des voies respiratoires 13 . Le modèle organoïde n’est pas illimité comme les lignées cellulaires immortalisées, mais peut être étendu par reprogrammation conditionnelle (en utilisant des fibroblastes d’alimentation irradiés et inactivés et des inhibiteurs de rho-kinase) à un état plus semblable à celui des cellules souches 20,21,22,23. Le traitement des biopsies au pinceau HNE à l’aide de cette méthode produit un grand nombre de cellules épithéliales pour une utilisation dans de multiples applications à un débit plus élevé tout en conservant la capacité de se différencier pleinement. Bien que ce protocole ait été élaboré à l’aide de cellules nourricières, d’autres méthodologies peuvent être utilisées par les chercheurs qui souhaitent éviter la technologie des cellules d’alimentation 14,24.
Importance de la technique pour la biologie pulmonaire
Une étude importante a été consacrée à la compréhension de la façon dont l’absence de CFTR régulier et fonctionnel dans la membrane cellulaire des cellules épithéliales entraîne un dysfonctionnement des poumons, du pancréas, du foie, de l’intestin ou d’autres tissus. Le transport dysfonctionnel des ions épithéliaux, en particulier celui du chlorure et du bicarbonate, entraîne une diminution du volume des fluides de la muqueuse épithéliale et des modifications des sécrétions muqueuses, entraînant une stase muqueuse et une obstruction. Dans d’autres maladies des voies respiratoires, telles que la dyskinésie ciliaire primaire, une altération du mouvement ciliaire altère la clairance mucociliaire et entraîne une stase muqueuse et une obstruction25. Par conséquent, le modèle organoïde HNE actuel a été développé pour diverses applications, en fonction de la conception expérimentale et des ressources de l’investigateur. Cela comprend l’imagerie de cellules vivantes à l’aide de taches de cellules vivantes; fixation et sectionnement pour caractériser la morphologie; coloration par immunofluorescence avec des anticorps et imagerie confocale à montage entier pour éviter de perturber les structures intraluminales; et l’imagerie en champ lumineux et la tomographie par cohérence micro-optique pour les mesures quantitatives de la fréquence des battements ciliaires et du transport mucociliaire13. Pour faciliter l’expansion à d’autres chercheurs, des réactifs et des fournitures disponibles dans le commerce ont été utilisés pour la culture. Un test fonctionnel a été développé qui utilisait des techniques de microscope courantes et un équipement plus spécialisé. Dans l’ensemble, bien que le présent modèle ait été conçu pour évaluer l’activité du CFTR au départ ou en réponse à des traitements, les techniques décrites dans ce protocole peuvent être appliquées à d’autres maladies impliquant la fonction des cellules épithéliales, en particulier le transport du liquide cellulaire épithélial.
Comparaison avec d’autres méthodologies
Récemment, l’utilité de ce modèle organoïde a été développée en corrélant les réponses in vitro du modulateur CFTR des organoïdes des patients avec leur réponse clinique11. Notamment, il est également démontré que le modèle actuel était parallèle aux réponses de courant de court-circuit, l’étalon-or actuel pour évaluer la fonction CFTR, chez les mêmes patients. Le courant de court-circuit diffère du test de gonflement car le premier mesure la fonction CFTR via le transport ionique26. En revanche, ce test mesure un effet plus en aval avec le transport de fluide, fournissant des informations supplémentaires sur la fonction globale du CFTR 27,28,29,30,31,32. Les mesures de courant de court-circuit ont continué d’être une méthode courante et fiable pour déterminer l’activitédu canal chlorure CFTR 1,33. Ces essais électrophysiologiques nécessitent un équipement spécialisé et coûteux, nécessitent beaucoup plus de cellules pour chaque réplication expérimentale que le test organoïde, ne peuvent pas être facilement automatisés et ne se prêtent pas à une mise à l’échelle pour des applications à haut débit. Un autre modèle organoïde dérivé de l’épithélium intestinal présente des avantages supplémentaires 15,16,17,18, tels qu’une capacité de réplication plus excellente, mais n’est ni dérivé d’un tissu des voies respiratoires ni universellement disponible. Les brossages HNE sont obtenus avec des brosses cytologiques peu coûteuses sans sédation et avec un risque minimal. L’obtention du brossage ne nécessite pas de clinicien et peut être effectuée par des coordonnateurs de recherche formés et d’autres membres du personnel de recherche14. Le modèle organoïde HNE peut être cultivé par n’importe quel laboratoire doté de capacités de culture cellulaire primaire, et certaines des applications peuvent être réalisées avec des techniques de microscopie standard. Dans l’ensemble, ces avantages offrent un accès supplémentaire à la technologie d’évaluation de la fonction épithéliale des voies respiratoires qui pourrait autrement ne pas être disponible pour certains laboratoires. En outre, les organoïdes HNE peuvent être utilisés pour étudier d’autres états pathologiques qui affectent les voies respiratoires, tels que la dyskinésie ciliaire primaire25 ou l’infection virale, ce que les organoïdes intestinaux ne peuvent pas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce manuscrit fournit des méthodologies détaillées pour l’imagerie complète en direct et fixe des organoïdes épithéliaux des voies respiratoires dérivés de la biopsie par brosse HNE. Il décrit les tests fonctionnels qui peuvent déterminer l’activité CFTR chez un individu. Les HNE fournissent un tissu primaire peu invasif pour une variété d’applications. Les techniques d’expansion proposées ici peuvent être utilisées pour modéliser les maladies des voies respiratoires, y compris les organoïdes. L…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions tous les participants qui ont fait don de biopsies à la brosse HNE pour développer ce protocole. Nous remercions Latona Kersh et le personnel de l’Unité de recherche pour enfants d’avoir coordonné le recrutement de volontaires de l’étude et les collectes d’échantillons. Nous remercions Lily Deng, Johnathan Bailey et Stephen Mackay, anciens stagiaires de notre laboratoire, pour leur assistance technique. Nous remercions Zhong Liu et Rui Zhao pour leur aide technique. Steven M. Rowe, directeur du Centre de recherche sur les FC à l’UAB, fournit un leadership et des ressources sans lesquels ce travail ne serait pas possible. Nous tenons également à remercier Sarah Guadiana de Biotek pour son aide à la formation aux instruments, Robert Grabski pour l’assistance en microscopie confocale au centre d’imagerie haute résolution de l’UAB et Dezhi Wang pour son assistance histologique au noyau d’histologie de l’UAB. Ce travail a été soutenu par les National Institutes of Health (NIH). Grant K23HL143167 (à JSG), Cystic Fibrosis Foundation (CFF), Grant GUIMBE18A0-Q (à JSG), le Gregory Fleming James Cystic Fibrosis Center [NIH Grants R35HL135816 et DK072482 et le CFF University of Alabama at Birmingham (UAB) Research and Development Program (Rowe19RO)], et le UAB Center for Clinical and Translational Science (NIH Grant UL1TR001417).
Materials
| Nasal brush | Medical Packaging CYB1 | CYB-1 | Length: 8 inches, width approximately 7 mm |
| Large-Orifice Pipette Tips | ThermoFisher Scientific | 02-707-141 | Large bore pipette tips |
| Accutase | ThermoFisher Scientific | A1110501 | Cell detachment solution |
| 0.05% trypsin -EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| Trypsin inhibitor from soybean | Sigma | T6522 | Working solution: 1mg/mL in 1XDPBS |
| Matrigel matrix | Corning | 356255 | Extracellular matrix (EM) |
| µ-Slide Angiogenesis | Ibidi | 81506 | 15-well slide |
| 24-Well Transwell | Corning | 7200154 | Culture insert |
| Chambered Coverglass | ThermoFisher Scientific | 155409 | 8-well glass-bottom chamber slides |
| Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive | ThermoFisher Scientific | 354240 | Cell adhesive |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 50980487 | |
| Triton X-100 | Alfa Aesar | A16046 | |
| BSA | ThermoFisher Scientific | BP1600-100 | |
| NucBlue | ThermoFisher Scientific | R37605 | DAPI |
| Eclipse Ts2-FL (Inverted Routine Microscope) | Nikon | Inverted epi-fluorescence microscope or bright-field microscope | |
| Nikon A1R-HD25 | Nikon | Confocal microscope | |
| NIS Elements- Basic Research | Nikon | manual imaging analysis software | |
| Histogel | ThermoFisher Scientific | HG-4000-012 | |
| Disposable Base Molds | ThermoFisher Scientific | 41-740 | |
| Lionheart FX | BioTek | BTLFX | Automated image system |
| Lionheart Cover | BioTek | BT1450009 | Environmental Control Lid |
| Humidity Chamber | BioTek | BT1450006 | Stage insert (environmental chamber) |
| Gas Controller for CO2 and O2 | BioTek | BT1210013 | Gas controller |
| Microplate/Slide Stage Insert | BioTek | BT1450527 | Slide holder |
| Gen5 Imaging Prime Software | BioTek | BTGEN5IPRIM | Automated imaging analysis software |
| 4x Phase Contrast Objective | BioTek | BT1320515 | |
| 10x Phase Contrast Objective | BioTek | BT1320516 | |
| LED Cube | BioTek | BT1225007 | |
| Filter Cube (DAPI) | BioTek | BT1225100 | DAPI |
| CFTRinh-172 | Selleck Chemicals | S7139 | |
| Forskolin | Sigma | F6886 | |
| IBMX | Sigma | I5879 | |
| Expansion Media | |||
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11965 | |
| F12 Nutrient mix | ThermoFisher Scientific | 11765 | |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher Scientific | 16140-071 | |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15-140-122 | |
| Cholera Toxin | Sigma | C8052 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | ThermoFisher Scientific | PHG0314 | |
| Hydrocortisone (HC) | Sigma | H0888 | |
| Insulin | Sigma | I9278 | |
| Adenine | Sigma | A2786 | |
| Y-27632 | Stemgent | 04-0012-02 | |
| Antibiotic Media | |||
| Ceftazidime | Alfa Aesar | J66460-03 | |
| Tobramycin | Alfa Aesar | J67340 | |
| Vancomycin | Alfa Aesar | J67251 | |
| Amphotericin B | Sigma | A2942 | |
| Differentiation Media | |||
| DMEM/F-12 (1:1) | ThermoFisher Scientific | 11330-32 | |
| Ultroser-G | Pall | 15950-017 | |
| Fetal Clone II | Hyclone | SH30066.03 | |
| Bovine Brain Extract | Lonza | CC-4098 | |
| Insulin | Sigma | I-9278 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H-0888 | |
| Triiodothyronine | Sigma | T-6397 | |
| Transferrin | Sigma | T-0665 | |
| Ethanolamine | Sigma | E-0135 | |
| Epinephrine | Sigma | E-4250 | |
| O-Phosphorylethanolamine | Sigma | P-0503 | |
| Retinoic Acid | Sigma | R-2625 | |
| Primary antibodies | |||
| Human CFTR antibody | R&D Systems | MAB1660 | Dilution: 100x |
| ZO-1 antibody | Thermo Fisher | MA3-39100-A647 | Dilution: 1000x |
| Anti-MUC5B antibody | Sigma | HPA008246 | Dilution: 100x |
| Anti-acetylated tubulin | Sigma | T7451 | Dilution: 100x |
| Anti-beta IV Tubulin antibody | Abcam | Ab11315 | Dilution: 100x |
| Secondary antibodies | |||
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21202 | Dilution: 2000x |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A21207 | Dilution: 2000x |
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