Coltura e imaging di organoidi epiteliali nasali umani
Summary
Un protocollo dettagliato è presentato qui per descrivere un modello organoide in vitro da cellule epiteliali nasali umane. Il protocollo ha opzioni per le misurazioni che richiedono apparecchiature di laboratorio standard, con possibilità aggiuntive per attrezzature e software specializzati.
Abstract
La terapia individualizzata per i pazienti con fibrosi cistica (FC) può essere ottenuta con un modello di malattia in vitro per comprendere l’attività basale del regolatore di conduttanza transmembrana della fibrosi cistica (CFTR) e il ripristino da composti di piccole molecole. Il nostro gruppo si è recentemente concentrato sulla creazione di un modello organoide ben differenziato direttamente derivato dalle cellule epiteliali nasali umane primarie (HNE). L’istologia degli organoidi sezionati, la colorazione immunofluorescente a montaggio intero e l’imaging (utilizzando microscopia confocale, microscopia immunofluorescente e campo luminoso) sono essenziali per caratterizzare gli organoidi e confermare la differenziazione epiteliale in preparazione di saggi funzionali. Inoltre, gli organoidi HNE producono lumen di varie dimensioni che si correlano con l’attività CFTR, distinguendo tra organoidi CF e non CF. In questo manoscritto, la metodologia per la coltivazione degli organoidi HNE è descritta in dettaglio, concentrandosi sulla valutazione della differenziazione utilizzando le modalità di imaging, compresa la misurazione dell’area del lume basale (un metodo di misurazione dell’attività CFTR negli organoidi che qualsiasi laboratorio con un microscopio può impiegare) e l’approccio automatizzato sviluppato a un saggio funzionale (che richiede attrezzature più specializzate).
Introduction
Introduzione alla tecnica
I saggi basati su colture ex vivo sono uno strumento sempre più utilizzato per la medicina di precisione e lo studio della fisiopatologia della malattia. La coltura cellulare primaria dell’epitelio nasale umano (HNE) è stata utilizzata in numerosi studi sulla fibrosi cistica 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 , una malattia autosomica recessiva che colpisce la funzione delle cellule epiteliali in più organi. La coltura HNE fornisce una fonte rinnovabile di epiteli delle vie aeree che possono essere ottenuti in modo prospettico e ricapitola le qualità elettrofisiologiche e biochimiche per testare l’attività del regolatore di conduttanza transmembrana della fibrosi cistica (CFTR). Le cellule HNE possono essere campionate con effetti collaterali minimi14, simili ai comuni tamponi respiratori virali. Il lavoro di ricerca che descrive un modello per lo studio della fibrosi cistica derivato da biopsie del pennello HNE è stato recentemente pubblicato11,13. Mentre simile ad altri modelli che utilizzano HNEprimario 2,3 e tessuto intestinale 15,16,17,18,19, la caratterizzazione dettagliata della differenziazione e dell’imaging di questo modello sono descritte qui per l’uso nella ricerca CF e per aiutare negli studi di altre malattie delle vie aeree13 . Il modello organoide non è illimitato come le linee cellulari immortalizzate, ma può essere espanso mediante riprogrammazione condizionale (utilizzando fibroblasti di alimentazione irradiati e inattivati e inibitori della Rho-chinasi) a uno stato più simile alle cellule staminali 20,21,22,23. L’elaborazione di biopsie a pennello HNE utilizzando questo metodo produce un gran numero di cellule epiteliali da utilizzare in più applicazioni a un throughput più elevato, pur mantenendo la capacità di differenziarsi completamente. Mentre questo protocollo è stato sviluppato utilizzando cellule di alimentazione, altre metodologie possono essere utilizzate dagli investigatori che desiderano evitare la tecnologia delle cellule di alimentazione14,24.
Importanza della tecnica per la biologia polmonare
Uno studio significativo è stato dedicato alla comprensione di come l’assenza di CFTR regolare e funzionante nella membrana cellulare delle cellule epiteliali provoca disfunzioni nei polmoni, nel pancreas, nel fegato, nell’intestino o in altri tessuti. Il trasporto ionico epiteliale disfunzionale, in particolare quello di cloruro e bicarbonato, provoca una diminuzione del volume dei fluidi di rivestimento epiteliale e cambiamenti nelle secrezioni mucose, portando a stasi e ostruzione mucosa. In altre malattie delle vie aeree, come la discinesia ciliare primaria, il movimento ciliare alterato compromette la clearance mucociliare e porta alla stasi mucosa e all’ostruzione25. Pertanto, l’attuale modello di organoide HNE è stato sviluppato per varie applicazioni, a seconda del design sperimentale e delle risorse dello sperimentatore. Ciò include l’imaging di cellule vive utilizzando macchie di cellule vive; fissazione e sezionamento per caratterizzare la morfologia; colorazione immunofluorescenza con anticorpi e imaging confocale a montaggio intero per evitare di interrompere le strutture intraluminali; e imaging a campo luminoso e tomografia a coerenza micro-ottica per misure quantitative della frequenza del battito ciliare e del trasporto mucociliare13. Per facilitare l’espansione ad altri ricercatori, sono stati utilizzati reagenti e forniture disponibili in commercio per la coltivazione. È stato sviluppato un test funzionale che utilizzava tecniche di microscopio comuni e attrezzature più specializzate. Nel complesso, mentre il presente modello è stato progettato per valutare l’attività della CFTR al basale o in risposta alle terapie, le tecniche descritte in questo protocollo possono essere applicate ad altre malattie che coinvolgono la funzione delle cellule epiteliali, in particolare il trasporto di fluido cellulare epiteliale.
Confronto con altre metodologie
Recentemente l’utilità di questo modello organoide è stata sviluppata correlando le risposte in vitro del modulatore CFTR degli organoidi dei pazienti con la loro risposta clinica11. In particolare, è anche dimostrato che il modello attuale è parallelo alle risposte di corrente di cortocircuito, l’attuale gold standard per la valutazione della funzione CFTR, negli stessi pazienti. La corrente di cortocircuito differisce dal saggio di rigonfiamento perché il primo misura la funzione CFTR tramite il trasportoionico 26. Al contrario, questo test misura un effetto più a valle con il trasporto del fluido, fornendo ulteriori informazioni sulla funzione complessiva di CFTR 27,28,29,30,31,32. Le misurazioni della corrente di cortocircuito hanno continuato ad essere un metodo comune e affidabile per determinare l’attivitàdel canale del cloruro CFTR 1,33. Questi saggi elettrofisiologici richiedono attrezzature specializzate e costose, richiedono molte volte più celle per ogni replica sperimentale rispetto al saggio organoide, non possono essere facilmente automatizzati e non sono suscettibili di scalabilità per applicazioni a produttività più elevata. Un altro modello organoide derivato dagli epiteli intestinali ha ulteriori vantaggi 15,16,17,18, come una più eccellente capacità replicativa, ma non è né derivato da un tessuto delle vie aeree né è universalmente disponibile. Le spazzolature HNE sono ottenute con spazzole citologiche economiche senza la necessità di sedazione e con un rischio minimo. Ottenere la spazzolatura non richiede un medico e può essere eseguita da coordinatori di ricerca addestrati e altro personale di ricerca14. Il modello organoide HNE può essere coltivato da qualsiasi laboratorio con capacità di coltura cellulare primaria e alcune delle applicazioni possono essere eseguite con tecniche di microscopia standard. Complessivamente, questi vantaggi forniscono un ulteriore accesso alla tecnologia per valutare la funzione epiteliale delle vie aeree che altrimenti potrebbe non essere disponibile per alcuni laboratori. Inoltre, gli organoidi HNE possono essere utilizzati per studiare altri stati patologici che colpiscono le vie aeree, come la discinesia ciliare primaria25 o l’infezione virale, che gli organoidi intestinali non possono.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo manoscritto fornisce metodologie dettagliate per l’imaging completo vivo e fisso degli organoidi epiteliali delle vie aeree derivati dalla biopsia del pennello HNE. Descrive saggi funzionali che possono determinare l’attività CFTR in un individuo. Gli HNE forniscono un tessuto primario minimamente invasivo per una varietà di applicazioni. Le tecniche di espansione qui offerte possono essere utilizzate per modellare la malattia delle vie aeree, compresi gli organoidi. Gli organoidi possono essere utilizzati per a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Riconosciamo con gratitudine i contributi di tutti i partecipanti che hanno donato biopsie con pennello HNE per sviluppare questo protocollo. Ringraziamo Latona Kersh e lo staff dell’Unità di ricerca per bambini per aver coordinato il reclutamento di volontari di studio e le raccolte di campioni. Ringraziamo Lily Deng, Johnathan Bailey e Stephen Mackay, ex tirocinanti nel nostro laboratorio, per l’assistenza tecnica. Ringraziamo Zhong Liu e Rui Zhao per il loro aiuto tecnico. Steven M. Rowe, direttore del CF Research Center presso UAB, fornisce leadership e risorse, senza le quali questo lavoro non sarebbe possibile. Vorremmo anche ringraziare Sarah Guadiana di Biotek per l’assistenza con la formazione degli strumenti, Robert Grabski per l’assistenza alla microscopia confocale presso la UAB High-Resolution Imaging Facility e Dezhi Wang per l’assistenza istologica presso l’UAB Histology Core. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health (NIH). Grant K23HL143167 (a JSG), Cystic Fibrosis Foundation (CFF) Grant GUIMBE18A0-Q (a JSG), il Gregory Fleming James Cystic Fibrosis Center [NIH Grants R35HL135816 e DK072482 e il CFF University of Alabama at Birmingham (UAB) Research and Development Program (Rowe19RO)], e l’UAB Center for Clinical and Translational Science (NIH Grant UL1TR001417).
Materials
| Nasal brush | Medical Packaging CYB1 | CYB-1 | Length: 8 inches, width approximately 7 mm |
| Large-Orifice Pipette Tips | ThermoFisher Scientific | 02-707-141 | Large bore pipette tips |
| Accutase | ThermoFisher Scientific | A1110501 | Cell detachment solution |
| 0.05% trypsin -EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| Trypsin inhibitor from soybean | Sigma | T6522 | Working solution: 1mg/mL in 1XDPBS |
| Matrigel matrix | Corning | 356255 | Extracellular matrix (EM) |
| µ-Slide Angiogenesis | Ibidi | 81506 | 15-well slide |
| 24-Well Transwell | Corning | 7200154 | Culture insert |
| Chambered Coverglass | ThermoFisher Scientific | 155409 | 8-well glass-bottom chamber slides |
| Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive | ThermoFisher Scientific | 354240 | Cell adhesive |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 50980487 | |
| Triton X-100 | Alfa Aesar | A16046 | |
| BSA | ThermoFisher Scientific | BP1600-100 | |
| NucBlue | ThermoFisher Scientific | R37605 | DAPI |
| Eclipse Ts2-FL (Inverted Routine Microscope) | Nikon | Inverted epi-fluorescence microscope or bright-field microscope | |
| Nikon A1R-HD25 | Nikon | Confocal microscope | |
| NIS Elements- Basic Research | Nikon | manual imaging analysis software | |
| Histogel | ThermoFisher Scientific | HG-4000-012 | |
| Disposable Base Molds | ThermoFisher Scientific | 41-740 | |
| Lionheart FX | BioTek | BTLFX | Automated image system |
| Lionheart Cover | BioTek | BT1450009 | Environmental Control Lid |
| Humidity Chamber | BioTek | BT1450006 | Stage insert (environmental chamber) |
| Gas Controller for CO2 and O2 | BioTek | BT1210013 | Gas controller |
| Microplate/Slide Stage Insert | BioTek | BT1450527 | Slide holder |
| Gen5 Imaging Prime Software | BioTek | BTGEN5IPRIM | Automated imaging analysis software |
| 4x Phase Contrast Objective | BioTek | BT1320515 | |
| 10x Phase Contrast Objective | BioTek | BT1320516 | |
| LED Cube | BioTek | BT1225007 | |
| Filter Cube (DAPI) | BioTek | BT1225100 | DAPI |
| CFTRinh-172 | Selleck Chemicals | S7139 | |
| Forskolin | Sigma | F6886 | |
| IBMX | Sigma | I5879 | |
| Expansion Media | |||
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11965 | |
| F12 Nutrient mix | ThermoFisher Scientific | 11765 | |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher Scientific | 16140-071 | |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15-140-122 | |
| Cholera Toxin | Sigma | C8052 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | ThermoFisher Scientific | PHG0314 | |
| Hydrocortisone (HC) | Sigma | H0888 | |
| Insulin | Sigma | I9278 | |
| Adenine | Sigma | A2786 | |
| Y-27632 | Stemgent | 04-0012-02 | |
| Antibiotic Media | |||
| Ceftazidime | Alfa Aesar | J66460-03 | |
| Tobramycin | Alfa Aesar | J67340 | |
| Vancomycin | Alfa Aesar | J67251 | |
| Amphotericin B | Sigma | A2942 | |
| Differentiation Media | |||
| DMEM/F-12 (1:1) | ThermoFisher Scientific | 11330-32 | |
| Ultroser-G | Pall | 15950-017 | |
| Fetal Clone II | Hyclone | SH30066.03 | |
| Bovine Brain Extract | Lonza | CC-4098 | |
| Insulin | Sigma | I-9278 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H-0888 | |
| Triiodothyronine | Sigma | T-6397 | |
| Transferrin | Sigma | T-0665 | |
| Ethanolamine | Sigma | E-0135 | |
| Epinephrine | Sigma | E-4250 | |
| O-Phosphorylethanolamine | Sigma | P-0503 | |
| Retinoic Acid | Sigma | R-2625 | |
| Primary antibodies | |||
| Human CFTR antibody | R&D Systems | MAB1660 | Dilution: 100x |
| ZO-1 antibody | Thermo Fisher | MA3-39100-A647 | Dilution: 1000x |
| Anti-MUC5B antibody | Sigma | HPA008246 | Dilution: 100x |
| Anti-acetylated tubulin | Sigma | T7451 | Dilution: 100x |
| Anti-beta IV Tubulin antibody | Abcam | Ab11315 | Dilution: 100x |
| Secondary antibodies | |||
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21202 | Dilution: 2000x |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A21207 | Dilution: 2000x |
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