생체 발광을 사용하여 마우스의 유방암 성장 및 전이성 콜로니 형성 모니터링
Summary
여기에서, 우리는 다양한 유방암 세포주에서 루시퍼라제 및 녹색 형광 단백질 발현을 수반하는 비침습적 모니터링 방법을 설명한다. 이 프로토콜은 마우스에서 실시간으로 종양 형성 및 전이성 콜로니화를 모니터링하는 기술을 제공한다.
Abstract
유방암은 빈번한 이질적인 악성 종양이며 주로 먼 장기 전이로 인해 여성의 사망률의 두 번째 주요 원인입니다. 암세포가 유선지방 패드에 주입되는 널리 사용되는 동위원소 마우스 모델을 포함하여 여러 동물 모델이 생성되었다. 그러나, 이들 모델은 종양 성장 동역학 및 전이성 콜로니화를 모니터링하는 것을 도울 수 없다. 생쥐에서 실시간으로 암세포를 모니터링하는 최첨단 도구는 종양 생물학에 대한 이해를 크게 향상시킬 것입니다.
여기서, 루시퍼라아제와 녹색 형광 단백질(GFP)을 안정적으로 발현하는 유방암 세포주가 확립되었다. 구체적으로, 이 기술은 시험관 내에서 루시퍼라제 활성을 측정하고 이어서 비비만 당뇨병-중증 복합 면역결핍(NOD-SCID) 마우스의 유선지방 패드에 암세포를 이식함으로써 개시되는 두 개의 순차적 단계를 포함한다. 주사 후, 종양 성장 및 전이성 콜로니화 둘 모두는 비침습적 생체발광 이미징 시스템에 의해 실시간으로 모니터링된다. 이어서, 폐에서 GFP 발현 전이의 정량화는 관찰된 생체발광 결과를 검증하기 위해 형광 현미경에 의해 검사될 것이다. 루시퍼라아제와 형광 기반 검출 도구를 결합한 이 정교한 시스템은 유방암 치료제 및 질병 관리에 사용할 수 있는 큰 잠재력을 가지고 있는 생체 내 암 전이를 평가합니다.
Introduction
유방암은 전 세계적으로 빈번한 유형의 암으로, 미국에서 매년 약 250,000 건의 새로운 사례가 진단됩니다1. 높은 발생률에도 불구하고 새로운 항암제 세트는 유방암 환자 결과를 크게 개선했습니다2. 그러나 많은 환자들이 질병 재발과 전이성이 환자의 이환률과 사망률의 주요 원인 인 중요한 장기로 전이되어전이성 확산을 경험하기 때문에 이러한 치료법은 여전히 부적절합니다. 따라서, 유방암 연구의 주요 과제 중 하나는 원위 전이의 형성을 조절하는 분자 메커니즘을 규명하여 이들의 발달을 억제하는 새로운 수단을 개발하는 것이다.
암 전이는 세포가 원발성 종양에서 분리되어 혈액 순환을 통해 이웃 조직을 침범하는 역동적 인 과정입니다. 따라서, 세포가 유사한 전이성 캐스케이드를 겪는 동물 모델은 이러한 과정(3,4)을 지배하는 메카니즘의 식별을 용이하게 할 수 있다. 추가적으로, 이러한 생체내 모델은 유방암 치료제(5,6)를 개발하는데 필수적이다. 그러나, 이들 동위원소 모델은 효과가 종결시에 결정되기 때문에 실제 종양 성장 동역학을 나타낼 수 없다. 따라서 우리는 종양 발생과 전이성 식민지화를 실시간으로 탐지하는 루시페라아제 기반 도구를 확립했습니다. 추가적으로, 이들 세포는 GFP를 발현하여 전이성 콜로니를 검출한다. 이 접근법은 비교적 간단하며 어떠한 침습적 절차도 수반하지 않는다3. 따라서, 루시퍼라아제와 형광 검출을 결합하는 것은 유방암 치료제 및 질병 관리의 전임상 연구를 진전시키는 데 유용한 전략이다.
Protocol
Representative Results
Discussion
동물 기반 실험은 암 연구 7,8,9에 필수적이며, 실제로 많은 프로토콜이 개발되었습니다 3,6,10,11,12,13,14. 그러나, 이들 연구의 대부분은 실험의 끝에?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Y.D.S. 연구소 회원들에게 감사드립니다. 예루살렘 하다사 메디컬 센터(Hadassah Medical Center)에 있는 Wohl Institute for Translational Medicine에 작은 동물 영상 시설을 제공해주신 것에 대해 감사드립니다. 이 연구는 이스라엘 암 연구 기금 (Israel Cancer Research Fund)의 연구 경력 개발 상 (Research Career Development Award) 의 지원을 받았다.
Materials
| 1.7 mL eppendorf tubes | Lifegene | LMCT1.7B-500 | |
| 10 µL tips | Lifegene | LRT10 | |
| 1000 µL tips | Lifegene | LRT1000 | |
| 15 mL tubes | Lifegene | LTB15-500 | |
| 200 µL tips | Lifegene | LRT200 | |
| 6 well cell culture plate | COSTAR | 3516 | |
| 96 well Plates BLACK flat bottom | Bar Naor | BN30496 | |
| Automated Cell Counters | Thermofisher | A50298 | |
| BD FACSAria III sorter | BD | ||
| BD Microlance 3 Needles 27 G (3/4'') | BD | 302200 | |
| BD Plastipak Syringes 1 mL x 120 | BD | 303172 | |
| Corning 100 mm x 20 mm Style Dish | CORNING | 430167 | |
| Corning 150 mm x 20 mm Style Dish | CORNING | 430599 | |
| Countess cell counting chamber slides | Thermofisher | C10228 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), high glucose, no glutamine | Biological Industries | 01-055-1A | |
| Eclipse 80i microscope | Nikon | ||
| eppendorf Centrifuge 5810 R | Sigma Aldrich | EP5820740000 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biological Industries | 04-127-1A | |
| FUW GFP | Gifted from Dr. Yossi Buganim's lab (Hebrew University of Jerusalem) | ||
| HEK293T | Gifted from Dr. Lior Nissim's lab (Hebrew University of Jerusalem) | ||
| Isoflurane, USP Terrell | Piramal | NDC 66794-01-25 | |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | 124262 | |
| L-Glutamine Solution | Biological industries | 03-020-1A | |
| Living Image Software | PerkinElmer | bioluminescence measurement | |
| MCF-7 | ATCC | ATCC HTB-22 | |
| MDA-MB-231 | ATCC | ATCC HTB-26 | |
| MDA-MB-468 | ATCC | ATCC HTB-132 | |
| Pasteur pipettes | NORMAX | 2430-475 | |
| PBS | Hylabs | BP655/500D | |
| pCMV-dR8.2-dvpr | Addgene | #8455 | Provided by David M. Sabatini’s lab (Whitehead institute, Boston, USA) |
| pCMV-VSV-G | Addgene | #8454 | Provided by David M. Sabatini’s lab (Whitehead institute, Boston, USA) |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Biological Industries | 03-031-1B | |
| Petri dish 90 mm (90×15) | MINI PLAST | 820-090-01-017 | |
| Pipettes 10ml | Lifegene | LG-GSP010010S | |
| Pipettes 25ml | Lifegene | LG-GSP010050S | |
| Pipettes 5ml | Lifegene | LG-GSP010005S | |
| pLX304 Luciferase-V5 blast plasmid | Addgene | #98580 | |
| Polybrene | Sigma Aldrich | #107689 | |
| Prism 9 | GraphPad | ||
| Reagent Reservoirs | Bar Naor | BN20621STR200TC | |
| SMZ18 Stereo microscopes | Nikon | ||
| Sodium Chloride | Bio-Lab | 190359400 | |
| Syringe filters | Lifegene | LG-FPV403030S | |
| Trypan Blue 0.5% solution | Biological industries | 03-102-1B | |
| Trypsin EDTA Solution B (0.25%), EDTA (0.05%) | Biological Industries | 03-052-1a | |
| Vacuum driven Filters | SOFRA LIFE SCIENCE | SPE-22-500 | |
| Virusolve | disinfectant | ||
| VivoGlo Luciferin, In Vivo Grade | Promega | P1043 | |
| X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent | Sigma Aldrich | #6366236001 |
References
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