生物発光を用いたマウスにおける乳がん増殖および転移性コロニー形成のモニタリング
Summary
ここでは、種々の乳癌細胞株におけるルシフェラーゼおよび緑色蛍光タンパク質発現を伴う非侵襲的モニタリング法について説明する。このプロトコルは、マウスにおける腫瘍形成および転移性コロニー形成をリアルタイムでモニターする技術を提供する。
Abstract
乳癌は、頻繁な不均一な悪性腫瘍であり、主に遠隔臓器転移による女性の死亡原因の第2位である。癌細胞が乳腺脂肪パッドに注入される広く使用されている同所性マウスモデルを含む、いくつかの動物モデルが作製されている。しかし、これらのモデルは、腫瘍増殖動態および転移性コロニー形成のモニタリングには役立たない。マウスのがん細胞をリアルタイムでモニタリングする最先端のツールは、腫瘍生物学の理解を大きく前進させるでしょう。
ここでは、ルシフェラーゼおよび緑色蛍光タンパク質(GFP)を安定に発現する乳癌細胞株が樹立された。具体的には、この技術は、 インビトロで ルシフェラーゼ活性を測定することによって開始され、続いて非肥満糖尿病重症複合免疫不全(NOD-SCID)マウスの乳腺脂肪パッドへの癌細胞の移植によって開始される2つの逐次ステップを含む。注射後、腫瘍増殖および転移性コロニー形成の両方が、非侵襲的生物発光画像化システムによってリアルタイムでモニターされる。次いで、肺におけるGFP発現転移の定量を蛍光顕微鏡により調べ、観察された生物発光結果を検証する。ルシフェラーゼと蛍光ベースの検出ツールを組み合わせたこの洗練されたシステムは、乳がんの治療や疾患管理に使用できる大きな可能性を秘めた 、生体内で のがん転移を評価します。
Introduction
乳がんは世界中で頻繁に発生するがんであり、米国では毎年約25万件の新規症例が診断されています1。その高い発生率にもかかわらず、抗がん剤の新しいセットは乳がん患者の転帰を有意に改善しました2。しかし、多くの患者が疾患の再発を経験し、患者の罹患率および死亡率の主な原因である重要な臓器2への転移性転移を経験するため、これらの治療は依然として不十分である。したがって、乳がん研究における主な課題の1つは、遠位転移の形成を調節する分子メカニズムを同定し、その発生を抑制する新しい手段を開発することである。
がん転移は、細胞が原発巣から剥離し、血液循環を介して隣接する組織に侵入する動的プロセスである。したがって、細胞が同様の転移性カスケードを受ける動物モデルは、このプロセス3、4を支配する機構の同定を容易にすることができる。さらに、これらの in vivo モデルは、乳癌治療剤5、6の開発に不可欠である。しかしながら、これらの同所性モデルは、効果が終了時にのみ決定されるため、実際の腫瘍増殖動態を示すことはできない。そこで、腫瘍の発生と転移性コロニー形成をリアルタイムで検出するルシフェラーゼベースのツールを確立しました。さらに、これらの細胞はGFPを発現し、転移性コロニーを検出する。このアプローチは比較的単純であり、侵襲的な処置を伴わない3。したがって、ルシフェラーゼと蛍光検出を組み合わせることは、乳がん治療薬および疾患管理の前臨床試験を進めるための有用な戦略である。
Protocol
Representative Results
Discussion
動物ベースの実験は、癌研究7、8、9のために必須であり、そして実際に多くのプロトコルが開発されている3、6、10、11、12、13、14。しかし、これら…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Y.D.S.研究室のメンバーの皆様に感謝いたします。エルサレムのハダサ医療センターのWohl Institute for Translational Medicineが、小動物イメージング施設を提供してくれたことに感謝します。この研究は、イスラエルがん 研究基金のリサーチキャリア開発賞 の支援を受けた。
Materials
| 1.7 mL eppendorf tubes | Lifegene | LMCT1.7B-500 | |
| 10 µL tips | Lifegene | LRT10 | |
| 1000 µL tips | Lifegene | LRT1000 | |
| 15 mL tubes | Lifegene | LTB15-500 | |
| 200 µL tips | Lifegene | LRT200 | |
| 6 well cell culture plate | COSTAR | 3516 | |
| 96 well Plates BLACK flat bottom | Bar Naor | BN30496 | |
| Automated Cell Counters | Thermofisher | A50298 | |
| BD FACSAria III sorter | BD | ||
| BD Microlance 3 Needles 27 G (3/4'') | BD | 302200 | |
| BD Plastipak Syringes 1 mL x 120 | BD | 303172 | |
| Corning 100 mm x 20 mm Style Dish | CORNING | 430167 | |
| Corning 150 mm x 20 mm Style Dish | CORNING | 430599 | |
| Countess cell counting chamber slides | Thermofisher | C10228 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), high glucose, no glutamine | Biological Industries | 01-055-1A | |
| Eclipse 80i microscope | Nikon | ||
| eppendorf Centrifuge 5810 R | Sigma Aldrich | EP5820740000 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biological Industries | 04-127-1A | |
| FUW GFP | Gifted from Dr. Yossi Buganim's lab (Hebrew University of Jerusalem) | ||
| HEK293T | Gifted from Dr. Lior Nissim's lab (Hebrew University of Jerusalem) | ||
| Isoflurane, USP Terrell | Piramal | NDC 66794-01-25 | |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | 124262 | |
| L-Glutamine Solution | Biological industries | 03-020-1A | |
| Living Image Software | PerkinElmer | bioluminescence measurement | |
| MCF-7 | ATCC | ATCC HTB-22 | |
| MDA-MB-231 | ATCC | ATCC HTB-26 | |
| MDA-MB-468 | ATCC | ATCC HTB-132 | |
| Pasteur pipettes | NORMAX | 2430-475 | |
| PBS | Hylabs | BP655/500D | |
| pCMV-dR8.2-dvpr | Addgene | #8455 | Provided by David M. Sabatini’s lab (Whitehead institute, Boston, USA) |
| pCMV-VSV-G | Addgene | #8454 | Provided by David M. Sabatini’s lab (Whitehead institute, Boston, USA) |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Biological Industries | 03-031-1B | |
| Petri dish 90 mm (90×15) | MINI PLAST | 820-090-01-017 | |
| Pipettes 10ml | Lifegene | LG-GSP010010S | |
| Pipettes 25ml | Lifegene | LG-GSP010050S | |
| Pipettes 5ml | Lifegene | LG-GSP010005S | |
| pLX304 Luciferase-V5 blast plasmid | Addgene | #98580 | |
| Polybrene | Sigma Aldrich | #107689 | |
| Prism 9 | GraphPad | ||
| Reagent Reservoirs | Bar Naor | BN20621STR200TC | |
| SMZ18 Stereo microscopes | Nikon | ||
| Sodium Chloride | Bio-Lab | 190359400 | |
| Syringe filters | Lifegene | LG-FPV403030S | |
| Trypan Blue 0.5% solution | Biological industries | 03-102-1B | |
| Trypsin EDTA Solution B (0.25%), EDTA (0.05%) | Biological Industries | 03-052-1a | |
| Vacuum driven Filters | SOFRA LIFE SCIENCE | SPE-22-500 | |
| Virusolve | disinfectant | ||
| VivoGlo Luciferin, In Vivo Grade | Promega | P1043 | |
| X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent | Sigma Aldrich | #6366236001 |
References
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