כאן אנו מתארים שיטת ניטור לא פולשנית הכוללת לוציפראז וביטוי חלבון פלואורסצנטי ירוק בקווים שונים של תאי סרטן השד. פרוטוקול זה מספק טכניקה לניטור היווצרות גידולים והתיישבות גרורתית בזמן אמת בעכברים.
סרטן השד הוא ממאירות הטרוגנית תכופה והגורם השני המוביל לתמותה אצל נשים, בעיקר עקב גרורות איברים מרוחקות. מספר מודלים של בעלי חיים נוצרו, כולל מודלים של עכברים אורתוטופיים הנמצאים בשימוש נרחב, שבהם מוזרקים תאים סרטניים לתוך כרית השומן של החלב. עם זאת, מודלים אלה אינם יכולים לסייע במעקב אחר קינטיקה של גדילת גידולים והתיישבות גרורתית. כלים חדשניים לניטור תאים סרטניים בזמן אמת בעכברים יקדמו באופן משמעותי את ההבנה של הביולוגיה של הגידול.
כאן נוצרו קווי תאי סרטן השד המבטאים ביציבות לוציפראז וחלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP). באופן ספציפי, טכניקה זו מכילה שני שלבים רציפים היזומים על ידי מדידת פעילות הלוציפראז במבחנה ולאחר מכן השתלת התאים הסרטניים לתוך כריות שומן יונקים של עכברי כשל חיסוני משולב (NOD-SCID) שאינם סוכרתיים חמורים. לאחר ההזרקה, הן צמיחת הגידול והן ההתיישבות הגרורתית מנוטרות בזמן אמת על ידי מערכת ההדמיה הביו-לומינסנציה הלא פולשנית. לאחר מכן, הכימות של גרורות המבטאות GFP בריאות ייבדק על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית כדי לאמת את תוצאות הביולומינסנציה שנצפו. מערכת מתוחכמת זו המשלבת לוציפראז וכלי גילוי מבוססי פלואורסצנציה מעריכה גרורות סרטניות in vivo, שיש לה פוטנציאל גדול לשימוש בטיפולים בסרטן השד ובניהול מחלות.
סרטן השד הוא סוגים שכיחים של סרטן ברחבי העולם, עם כ -250,000 מקרים חדשים מאובחנים מדי שנה בארצות הברית1. למרות ההיארעות הגבוהה שלה, קבוצה חדשה של תרופות נגד סרטן שיפרה באופן משמעותי את התוצאות של חולות סרטן השד2. עם זאת, טיפולים אלה עדיין אינם מספיקים, שכן חולים רבים חווים הישנות מחלות והתפשטות גרורתית לאיברים חיוניים2, שהיא הגורם העיקרי לתחלואה ולתמותה של המטופלים. לכן, אחד האתגרים המרכזיים בחקר סרטן השד הוא זיהוי המנגנונים המולקולריים המווסתים את היווצרותן של גרורות דיסטליות כדי לפתח אמצעים חדשים לעיכוב התפתחותן.
גרורות סרטניות הן תהליך דינמי שבו תאים מתנתקים מהגידול הראשוני ופולשים לרקמות שכנות דרך זרימת הדם. לפיכך, מודלים של בעלי חיים שבהם התאים עוברים מפל גרורתי דומה יכולים להקל על זיהוי המנגנונים השולטים בתהליך זה 3,4. בנוסף, מודלים אלה של in vivo חיוניים לפיתוח חומרים טיפוליים לסרטן השד 5,6. עם זאת, מודלים אורתוטופיים אלה אינם יכולים להצביע על קינטיקה של גדילת הגידול בפועל מכיוון שההשפעה נקבעת רק עם סיום הלימודים. לכן, הקמנו כלי מבוסס לוציפראז כדי לזהות התפתחות גידולים והתיישבות גרורתית בזמן אמת. בנוסף, תאים אלה מבטאים GFP כדי לזהות את המושבות הגרורות. גישה זו היא פשוטה יחסית ואינה כרוכה בהליכים פולשניים3. לפיכך, שילוב של לוציפראז וזיהוי פלואורסצנציה הוא אסטרטגיה מועילה לקידום המחקרים הפרה-קליניים של טיפולים בסרטן השד וניהול מחלות.
ניסויים בבעלי חיים הם חובה לחקר הסרטן 7,8,9, ואכן פותחו פרוטוקולים רבים 3,6,10,11,12,13,14. עם זאת, רוב המחקרים הללו קבעו…
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים לחברי מעבדת Y.D.S. ברצוננו להודות למכון וואהל לרפואה תרגומית במרכז הרפואי הדסה בירושלים על אספקת המתקן להדמיית בעלי חיים קטנים. מחקר זה נתמך על ידי פרס פיתוח קריירה מחקרית מטעם הקרן לחקר הסרטן.
1.7 mL eppendorf tubes | Lifegene | LMCT1.7B-500 | |
10 µL tips | Lifegene | LRT10 | |
1000 µL tips | Lifegene | LRT1000 | |
15 mL tubes | Lifegene | LTB15-500 | |
200 µL tips | Lifegene | LRT200 | |
6 well cell culture plate | COSTAR | 3516 | |
96 well Plates BLACK flat bottom | Bar Naor | BN30496 | |
Automated Cell Counters | Thermofisher | A50298 | |
BD FACSAria III sorter | BD | ||
BD Microlance 3 Needles 27 G (3/4'') | BD | 302200 | |
BD Plastipak Syringes 1 mL x 120 | BD | 303172 | |
Corning 100 mm x 20 mm Style Dish | CORNING | 430167 | |
Corning 150 mm x 20 mm Style Dish | CORNING | 430599 | |
Countess cell counting chamber slides | Thermofisher | C10228 | |
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), high glucose, no glutamine | Biological Industries | 01-055-1A | |
Eclipse 80i microscope | Nikon | ||
eppendorf Centrifuge 5810 R | Sigma Aldrich | EP5820740000 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Biological Industries | 04-127-1A | |
FUW GFP | Gifted from Dr. Yossi Buganim's lab (Hebrew University of Jerusalem) | ||
HEK293T | Gifted from Dr. Lior Nissim's lab (Hebrew University of Jerusalem) | ||
Isoflurane, USP Terrell | Piramal | NDC 66794-01-25 | |
IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | 124262 | |
L-Glutamine Solution | Biological industries | 03-020-1A | |
Living Image Software | PerkinElmer | bioluminescence measurement | |
MCF-7 | ATCC | ATCC HTB-22 | |
MDA-MB-231 | ATCC | ATCC HTB-26 | |
MDA-MB-468 | ATCC | ATCC HTB-132 | |
Pasteur pipettes | NORMAX | 2430-475 | |
PBS | Hylabs | BP655/500D | |
pCMV-dR8.2-dvpr | Addgene | #8455 | Provided by David M. Sabatini’s lab (Whitehead institute, Boston, USA) |
pCMV-VSV-G | Addgene | #8454 | Provided by David M. Sabatini’s lab (Whitehead institute, Boston, USA) |
Penicillin-Streptomycin Solution | Biological Industries | 03-031-1B | |
Petri dish 90 mm (90×15) | MINI PLAST | 820-090-01-017 | |
Pipettes 10ml | Lifegene | LG-GSP010010S | |
Pipettes 25ml | Lifegene | LG-GSP010050S | |
Pipettes 5ml | Lifegene | LG-GSP010005S | |
pLX304 Luciferase-V5 blast plasmid | Addgene | #98580 | |
Polybrene | Sigma Aldrich | #107689 | |
Prism 9 | GraphPad | ||
Reagent Reservoirs | Bar Naor | BN20621STR200TC | |
SMZ18 Stereo microscopes | Nikon | ||
Sodium Chloride | Bio-Lab | 190359400 | |
Syringe filters | Lifegene | LG-FPV403030S | |
Trypan Blue 0.5% solution | Biological industries | 03-102-1B | |
Trypsin EDTA Solution B (0.25%), EDTA (0.05%) | Biological Industries | 03-052-1a | |
Vacuum driven Filters | SOFRA LIFE SCIENCE | SPE-22-500 | |
Virusolve | disinfectant | ||
VivoGlo Luciferin, In Vivo Grade | Promega | P1043 | |
X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent | Sigma Aldrich | #6366236001 |