Meme epitel hücreleri ve endotel hücreleri arasındaki çapraz konuşma, meme kanserinin ilerlemesine, tümör büyümesine ve metastaz yapmasına önemli ölçüde katkıda bulunur. Bu çalışmada meme kanseri hücrelerinden vasküler ve/veya lenfatik endotel hücreleri ile birlikte sferoidler yapılmış ve meme kanseri araştırmaları için in vitro sistem olarak uygulanabilirliklerini ortaya koymaktadır.
Meme kanseri kadınlarda mortalitenin önde gelen nedenidir. Meme kanseri hücrelerinin büyümesi ve sonraki metastazları ilerlemesi için önemli bir faktördür. McF-7 hücreleri gibi meme kanseri hücrelerinin monokültürleri kullanılarak meme kanseri büyümesini teşvik eden mekanizmalar yoğun bir şekilde çalışılmış olsa da tümör büyümesinde yakından yer alan damar ve lenfatik endotel hücreleri gibi diğer hücre tiplerinin katkısı derinlemesine araştırılmamıştır. Hücre-hücre etkileşimi tümör büyümesinde ve ilerlemesinde kilit rol oynar. Neoangiogenez veya damarların gelişimi tümör büyümesi için gereklidir, lenfatik sistem ise kanser hücre göçü ve sonraki metastaz için bir portal görevi görür. Son çalışmalar, vasküler ve lenfatik endotel hücrelerinin kanser hücre büyümesini önemli ölçüde etkileyebileceğine dair kanıtlar sürmektedir. Bu gözlemler, meme kanseri büyüme süreçlerini daha gerçekçi bir şekilde yansıtacak in vitro modeller geliştirmeye ihtiyaç olduğunu ima ediyor vivo. Ayrıca, hayvan araştırmalarındaki kısıtlamalar, ilgili mekanizmaları daha iyi aydınlatmak için ex vivo modellerinin geliştirilmesini gerektirir.
Bu makalede hem meme kanseri hücrelerinden (östrojen reseptörü pozitif MCF-7 hücreleri) hem de vasküler ve/veya lenfatik endotel hücrelerinden oluşan meme kanseri sferoidlerinin gelişimi açıklanmaktadır. Protokol, asılı damla (altın standart ve ucuz) ve 96 kuyulu U-alt plakalar (pahalı) olmak üzere iki farklı yaklaşım kullanarak çift hücreli küreseller oluşturmada ayrıntılı bir adım adım yaklaşımı açıklar. Mikroskobik boyutlandırma ve ölü ve canlı hücre boyama kullanarak canlılığı değerlendirerek büyümeyi izlemek için oluşturulan küresellerin hassas bir şekilde nasıl toplanacağınız için derinlemesine talimatlar sağlanmıştır. Ayrıca, sferoidlerdeki büyüme modellerini ayırt etmek için büyümeye özgü antikorlarla kesitleme ve boyama için küreseloidleri düzeltme prosedürleri deliner. Ek olarak, transfected hücreli sferoidlerin hazırlanmasına yönelik ayrıntılar ve moleküler analiz için RNA çıkarma yöntemleri sağlanmaktadır. Sonuç olarak, bu makale meme kanseri araştırmaları için çok hücreli sferoidler hazırlamak için derinlemesine talimatlar sunmaktadır.
Hayvanların deneyler için kullanılmasının sınırlamaları vardır. Hayvan çalışmaları insanlarda hastalığın ilerlemesini doğru bir şekilde taklit edemez ve hayvanlar ve insanlar patojenlere aynı yanıtlara sahip değildir. Ayrıca, hayvan acılarına ve etik sorunlara yönelik endişeler nedeniyle hayvan deneylerindeki kısıtlamalar1,2 araştırma programlarını giderek kısıtlar. In vitro hayvanların kullanımını atlatmak için yaygın olarak geliştirilmiştir; ayrıca, insan hücrelerinin kullanımı in vitro patofizyolojik ve terapötik araştırma için daha uygun modeller. Konvansiyonel monolayer (2D) hücre kültürleri, insan dokularını bir dereceye kadar taklit ettikleri için yaygın olarak kullanılmaktadır. Bununla birlikte, 2B monokültürler insan organlarını taklit edemez ve 2B monokültürler orijinal organların karmaşık mikroçevresini simüle edemez ve in vivo durum3,4,5,6. Ek olarak, monolayer hücre kültürlerinde, ilaç tedavileri tüm hücreleri kolayca yok edebilir / zarar verebilir. Daha da önemlisi, bu sınırlamaların bazıları çok katmanlı üç boyutlu (3D) hücre kültürlerine geçerek aşılabilir7,8. Aslında, 3D kültür modellerinin birincil dokulardaki hücrelerin hücresel yapısını, düzenini ve işlevini daha iyi yansıttığı gösterilmiştir. Bu 3D kültürler, işlevsel bir organa benzer şekilde çeşitli hücre çizgileri kullanılarak oluşturulabilir. Gerçekten de, 3D kültürlerin iki modeli vardır. Bir model, kümeler oluşturan ve bunları kürelere (iskelesiz modeller) yeniden düzenlenen agrega hücrelerin küresellerini üretir. İkincisi, daha karmaşık bir yapıya sahip olan ve organların minyatür bir versiyonu olarak kabul edilen birden fazla organa özgü hücrenin kombinasyonlarından oluşan organoidleri verir.9,10. Bu nedenle, 3D kültür sistemleri birçok biyolojik ve klinik uygulama ile yenilikçi bir teknolojiyi temsil eder. Bu nedenle, sferoidler ve organoidler rejeneratif tıp, ilaç taraması ve toksikolojik çalışmalarla ilgili hastalık modelleme ve çalışmaları için çok sayıda uygulamaya sahiptir.6,11,12,13,14,15. 3D teknolojisinden türetilen kanserojen küreseller, ilgili hücre tiplerinin morfolojisini ve fenotipini yeniden oluşturmak, in vivo tümör mikroçevrİmİ ve tümör gelişimi sırasında çalışır durumda olan model hücre iletişimi ve sinyal yolları16,17,18. Ek olarak, kanser biyolojisi anlayışını geliştirmek için tümör sferoidleri/organoidleri, potansiyel bir hastaya özgü kanser önleyici tedaviyi (kişiselleştirilmiş) tanımlamak ve etkinliğini, toksisitesini ve uzun vadeli etkilerini değerlendirmek için de kullanılabilir.19,20,21,22. Küreseller, hücresel ve üç boyutlu doku mimarisini koruma yetenekleri, in vivo durumu ve hücre-hücre etkileşimleri. Bununla birlikte, damar / sistemik bileşen eksikliği, fonksiyonel bağışıklık veya sinir sistemi gibi bu sistemin sınırlamalarının da farkında olmak gerekir ve sistem hayvan modellerine kıyasla indirgemeci bir yaklaşımı temsil eder. Gerçekten de, hayvan modellerinin aksine, 3D yapılar bir insan vücudundaki biyolojinin sadece bir yaklaşıkını sağlar. 3D yönteminin sınırlamalarını anlamak, araştırmacıların bir organı daha büyük ölçekte daha iyi temsil eden küreseller üretmek için daha rafine ve geçerli süreçler tasarlamalarına yardımcı olabilir23,24,25.
Kanser dünya çapında önde gelen ölüm nedenidir ve meme kanseri kadınlarda en sık görülen kanserdir26,27,28. Meme kanserinin karmaşık mikroçevresini taklit etmek için meme kanseri sferoidleri meme tümörlerinde, yani epitel hücrelerinde, endotel hücrelerinde, fibroblastlarda ve/veya bağışıklık hücrelerinde önemli rol oynayan hücreler kullanılarak kültürlenmelidir. Ayrıca, meme kanserini temsil eden bir sferoid için, kadın hormon reseptörlerinin (östrojen/ progesteron reseptörleri), hasta tümör histolojik durumunu koruma yeteneği ve tedaviye yanıtı taklit etme yeteneği de göz önünde bulundurulmalıdır. Çalışmalar, 3D ortak kültür sistemlerinin birincil doku in vivo’nunkinebenzer bir hücresel kuruluşa sahip olduğunu, uyaranlara gerçek zamanlı tepki verme yeteneğine sahip olduğunu ve fonksiyonel androjen reseptörlerine sahip olduğunu göstermiştir29,30,31,32. Bu nedenle, benzer bir yaklaşım bir meme tümörü in vitrotaklit yararlı olabilir. Mevcut protokolün amacı meme kanseri sferoidleri üretmek için yeni bir yöntem oluşturmaktır. Bu yöntem, bir tümör içindeki bu hücreler arasındaki etkileşimleri taklit eden veya yakından yansıtan bir model oluşturmak için östrojen reseptörü pozitif MCF-7 hücrelerini (epitel hücrelerinin ölümsüzleştirilmiş bir insan hücresi hattı) ve vasküler endotel hücrelerini (HUVEC’ler) veya lenfatik endotel hücrelerini (HMVEC-DNeo) kullanır. McF-7 (östrojene duyarlı) ve endotel hücreleri bu çalışmada sferoid geliştirmek için kullanılmış olsa da, meme tümörü kitlesinin ~%80’ini temsil eden fibroblastlar gibi diğer hücreler de gelecekte meme tümörünü daha iyi temsil etmek ve taklit etmek için birleştirilebilir.
Sferoid oluşturmak için aşağıdakiler gibi çeşitli yöntemler vardır: 1) yerçekimini kullanan asılı damlacık yöntemi33,34; 2) harici bir mıknatısa maruz kalan manyetik nanopartikülleri kullanan manyetik kaldırma yöntemi35ve 3) düşük ekli plakalarda tohumlama hücreleri tarafından gerçekleştirilen küresel mikro plaka yöntemi36,37. Sadece bir hücre tipi kullanan mevcut yöntemlere dayanarak, mevcut protokol, memekanseri tümörlerinin büyüme koşullarını daha iyi taklit etmek için epitel ve endotel hücreleri kullanılarak optimize edilmiştir38,39,40,41. Bu yöntem laboratuvarda düşük maliyetle ve minimum ekipman gereksinimi ile kolayca elde edilebilir. Laboratuvarın ihtiyacına/hedeflerine göre, sferoid oluşturmak ve bu sferoidlerden ilgili hücresel materyali kazanmak için farklı yaklaşımlar kullanılmıştır. Bu bağlamda, DNA, RNA veya protein analizi için, 3D sferoidler, sarkan damla yöntemi ile endotel ve epitel hücrelerinin birlikte kült ederek üretilir. Bununla birlikte, fonksiyonel çalışmalar için, örneğin, kısa müdahale (siRNA) transfeksiyon ve / veya hormon tedavisinden sonra hücre büyümesini izlemek için, küreseller U-alt plakaları kullanılarak üretilir.
Bu teknik protokolün amacı, 1) meme kanseri çok hücreli tip sferoidlerin oluşturulması, 2) histolojik lekelenme için örneklerin hazırlanması ve 3) RNA, DNA ve proteinlerin çıkarılması için hücrelerin toplanması için ayrıntılı bir adım adım açıklama sağlamaktır. Hem ucuz asma bırakma yöntemi hem de daha pahalı U-alt plakalar sferoid oluşturmak için kullanılır. Burada, hücre çoğalmasını, apoptoz ve epitel ve endotel hücrelerinin bir küresel hücre içinde dağılımını değerlendirmek için sferoidlerin kesit ve sonraki immünostaining için hazırlanması (sabitlenerek) için bir protokol sağlanmaktadır. Ayrıca, bu protokol ImageJ yazılımını kullanarak histolojik verilerin tam bir adım adım analizini gösterir. Biyolojik verilerin yorumlanması, deneyin türüne ve kullanılan antikorlara bağlı olarak değişir. Sabit sferoidlerin bölümlenerek yapılması ve daha sonra bölümlerin boyanma işlemi rutin bir patoloji laboratuvarı tarafından gerçekleştirildi (Sophistolab: info@sophistolab.ch)
2D hücre kültürleri ile karşılaştırıldığında, devrimci 3D küresel kültür teknolojisi, bir organın mikroçevresini, hücre-hücre etkileşimlerini ve ilaç yanıtlarını in vitroolarak yeniden oluşturmak için daha iyi ve daha güçlü bir araçtır. Bu, meme kanseri araştırmaları için çok hücreli (epitel ve endotel) hücre çizgilerinden sferoid oluşumunu tanımlayan ilk protokoldür. Bu protokol, sferoidlerin 5 güne kadar küresel 3D büyümesini sağlar ve parafin gömme, bölümleme v…
The authors have nothing to disclose.
Bu araştırma Kanser Araştırma Vakfı / İsviçre Kanser Ligi hibesi KFS-4125-02-2017 RKD ve Ulusal Sağlık Enstitüsü tarafından EKJ’ye DK079307 hibesi ile desteklenmiştir.
100 mm × 20 mm tissue-culture treated culture dishes | Corning | CLS430167 | |
149MULTI0C1 | |||
35 x 10 mm Tissue Culture Dish | Falcon | 353001 | |
5 mL Serological Pipet, Polystyrene, Individually Packed, Sterile | Falcon | 357543 | |
Adobe Photoshop | Version: 13.0.1 (64-bit) | ||
Antibiotic Antimycotic Solution (100×) | Sigma-Aldrich | A5955 | |
Calcein-AM | Sigma-Aldrich | 17783 | |
CD31 (cluster of differentiation 31) | Cell Marque | 131M-95 | monoclonal mouse ab clone JC70 |
CellTracker Green CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetate) | Invitrogen | C7025 | |
CK8/18 (cytokeratins 8 and 18) | DBS | Mob189-05 | monoclonal mouse ab, clone 5D3 |
CKX41 Inverted Microscope | Olympus Life Science | Olympus DP27 digital camera | |
Cleaved Caspase 3 | Cell Signaling | 9661L | polyclonal rabbit ab |
Collagen (rat tail) | Roche | 11 179 179 001 | |
Coulter ISOTON II Diluent | Beckman Coulter | 844 80 11 | Diluent II |
Coulter Z1, Cell Counter | Coulter Electronics, Luton, UK | ||
Dehydrated Culture Media: Noble Agar | BD Difco | BD 214220 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham | Sigma-Aldrich | D6434 | |
EBM-2 Endothelial Cell Growth Basal Medium-2 | Lonza | 190860 | |
Ethidium homodimer | Sigma-Aldrich | 46043 | |
Fetal Calf Serum (FCS) | Thermo Fisher Scientific | SH30070 | |
Fetal Calf Serum Charcoal Stripped (FCS sf) | Thermo Fisher Scientific | SH3006803 | |
Fluorescence stereo microscopes Leica M205 FA | Leica Microsystems | ||
GlutaMAX Supplement (100x) | Gibco | 35050038 | |
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | Gibco | 14175053 | |
Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | |
HUVEC – Human Umbilical Vein Endothelial Cells | Lonza | CC-2517 | |
ImageJ | National Institute of Health, USA | Wayne Rasband Version: 1.52a (64-bit) |
|
Ki67 | Cell Marque | 275R-16 | monoclonal rabbit ab, clone SP6 |
Leica Histocore Multicut Rotary Microtome | 149MULTI0C1 | ||
Low Serum Growth Supplement Kit (LSGS Kit) | Gibco | S003K | |
MCF-7 cells – human breast adenocarcinoma cell line | Clinic for Gynecology, University Hospital Zurich | Provived from Dr Andrè Fedier obtained from ATCC | |
Nunclon Sphera 96U-well plate | Thermo Fisher Scientific | 174925 | |
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148 | |
Phosphate-buffered saline (PBS) 1x | Gibco | 10010015 | |
Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
Protein Lysis Buffer | Cell Signaling, Danvers, USA | 9803 | |
Quick-RNA Miniprep Kit | Zymo Research | R1055 | |
RNA Lysis Buffer | Zymo Research | R1060-1-100 | Contents in Quick-RNA Miniprep Kit |
Rotina 46R Centrifuge | Hettich | ||
Round-Bottom Polystyrene Tubes, 5 mL | Falcon | 352003 | |
Sonicator | Bandelin electronics, Berlin, DE | ||
Tecan Infinite series M200 microplate reader | Tecan, Salzburg, AU | ||
Tissue Culture Flasks 75 | TPP | 90076 | |
Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T3924 |