تساهم المحادثات المتقاطعة بين الخلايا الظهارية الثديية والخلايا البطانية بشكل كبير في تطور سرطان الثدي ونمو الورم والانبثاث. في هذه الدراسة، تم صنع كرويدات من خلايا سرطان الثدي جنبا إلى جنب مع الخلايا البطانية الوعائية و / أو اللمفاوية وإثبات قابليتها للتطبيق كنظام في المختبر لأبحاث سرطان الثدي.
سرطان الثدي هو السبب الرئيسي للوفيات بين النساء. نمو خلايا سرطان الثدي ونقائلها اللاحقة هو عامل رئيسي لتطورها. على الرغم من أن الآليات المشاركة في تعزيز نمو سرطان الثدي قد درست بشكل مكثف باستخدام الثقافات الأحادية لخلايا سرطان الثدي مثل خلايا MCF-7 ، إلا أنه لم يتم التحقيق بعمق في مساهمة أنواع الخلايا الأخرى ، مثل الخلايا البطانية الوعائية واللمفاوية التي تشارك بشكل وثيق في نمو الورم. التفاعل بين الخلية والخلية يلعب دورا رئيسيا في نمو الورم وتطوره. تكوين النيوانجيوجينيسيس، أو تطور الأوعية، أمر ضروري لنمو الورم، في حين أن الجهاز اللمفاوي بمثابة بوابة لهجرة الخلايا السرطانية والانبثاث اللاحق. تقدم الدراسات الحديثة أدلة على أن الخلايا البطانية الوعائية واللمفاوية يمكن أن تؤثر بشكل كبير على نمو الخلايا السرطانية. هذه الملاحظات تعني الحاجة إلى تطوير نماذج في المختبر من شأنها أن تعكس بشكل أكثر واقعية عمليات نمو سرطان الثدي في الجسم الحي. وعلاوة على ذلك، تتطلب القيود المفروضة على البحوث الحيوانية تطوير نماذج الجسم الحي السابق لتوضيح أفضل للآليات المعنية.
توضح هذه المقالة تطور كرويات سرطان الثدي المكونة من كل من خلايا سرطان الثدي (خلايا MCF-7 الإيجابية لمستقبلات هرمون الاستروجين) والخلايا البطانية الوعائية و / أو اللمفاوية. يصف البروتوكول نهجا مفصلا خطوة بخطوة في إنشاء كرويات ثنائية الخلية باستخدام نهجين مختلفين ، إسقاط معلق (معيار الذهب ورخيصة) ولوحات U-bottom 96 جيدا (مكلفة). يتم توفير تعليمات متعمقة لكيفية التقاط بدقة كرويات شكلت لرصد النمو عن طريق التحجيم المجهري وتقييم الجدوى باستخدام تلطيخ الخلايا الميتة والحية. وعلاوة على ذلك، يتم تحديد إجراءات لإصلاح كرويدات للتقسم وتلطيخ مع الأجسام المضادة الخاصة بالنمو للتمييز بين أنماط النمو في كرويدات. بالإضافة إلى ذلك، يتم توفير تفاصيل لإعداد كرويدات مع الخلايا المصابة وأساليب لاستخراج الحمض النووي الريبي للتحليل الجزيئي. في الختام، توفر هذه المقالة تعليمات متعمقة لإعداد كرويات متعددة الخلايا لأبحاث سرطان الثدي.
استخدام الحيوانات للتجارب له حدود. لا يمكن للدراسات الحيوانية أن تحاكي بدقة تطور المرض لدى البشر، وليس لدى الحيوانات والبشر استجابات متطابقة لمسببات الأمراض. بالإضافة إلى ذلك، القيود المفروضة على التجارب على الحيوانات بسبب المخاوف من معاناة الحيوانات والمشاكل الأخلاقية1,2 تقييد برامج البحث بشكل متزايد. In vitro وقد وضعت نظم على نطاق واسع للتحايل على استخدام الحيوانات؛ وعلاوة على ذلك، فإن استخدام الخلايا البشرية جعلت in vitro نماذج أكثر ملاءمة للتحقيق المرضي والعلاجي. تستخدم ثقافات الخلايا أحادية الطبقة التقليدية (2D) على نطاق واسع لأنها تحاكي الأنسجة البشرية إلى حد ما. ومع ذلك ، تفشل الثقافات الأحادية 2D في محاكاة الأعضاء البشرية ، ولا تستطيع الثقافات الأحادية 2D محاكاة البيئة الدقيقة المعقدة للأعضاء الأصلية وتقليد in vivo موقف3,4,5,6. بالإضافة إلى ذلك ، في ثقافات الخلايا أحادية الطبقة ، يمكن أن تدمر العلاجات الدوائية / تلحق الضرر بكل الخلايا بسهولة. الأهم من ذلك ، يمكن التغلب على بعض هذه القيود عن طريق التحول إلى متعدد الطبقات ثلاثي الأبعاد (3D) ثقافات الخلية7,8. في الواقع، أظهرت نماذج الثقافة ثلاثية الأبعاد أنها تعكس بشكل أفضل البنية الخلوية والتخطيط ووظيفة الخلايا في الأنسجة الأولية. يمكن تشكيل هذه الثقافات ثلاثية الأبعاد باستخدام مجموعة متنوعة من خطوط الخلايا ، على غرار الجهاز الوظيفي. في الواقع ، هناك نموذجان من الثقافات ثلاثية الأبعاد. نموذج واحد ينتج كرويدات من الخلايا المجمعة التي تشكل مجموعات وإعادة تنظيمها في المجالات (نماذج خالية من السقالات). والثاني ينتج organoids ، التي لديها بنية أكثر تعقيدا وتتألف من مجموعات من خلايا متعددة خاصة بالأعضاء ، والتي تعتبر نسخة مصغرة من الأعضاء9,10. ونتيجة لهذا، تمثل أنظمة الثقافة ثلاثية الأبعاد تقنية مبتكرة مع العديد من التطبيقات البيولوجية والسريرية. وهكذا ، فإن كرويدات و organoids لديها العديد من التطبيقات لنمذجة الأمراض والدراسات المتعلقة الطب التجديدي ، وفحص الأدوية ، والدراسات السمية6,11,12,13,14,15. كرويات مسرطنة، مستمدة من التكنولوجيا ثلاثية الأبعاد، إعادة مورفولوجيا والنمط الظاهري لأنواع الخلايا ذات الصلة، تحاكي in vivo البيئة الدقيقة الورم، ونموذج الاتصالات الخلية ومسارات الإشارات التي تعمل أثناء تطور الورم16,17,18. بالإضافة إلى ذلك ، لتحسين فهم بيولوجيا السرطان ، يمكن أيضا استخدام كرويدات / عضويات الورم لتحديد علاج محتمل مضاد للسرطان خاص بالمرضى (شخصي) وتقييم فعاليته وسمية وآثاره على المدى الطويل19,20,21,22. وقد فتحت Spheroids فرصا بارزة للتحقيق في علم وظائف الأعضاء المرضية ، والنمذجة المرض وفحص المخدرات بسبب قدرتها على الحفاظ على بنية الأنسجة الخلوية وثلاثية الأبعاد ، والقدرة على تقليد in vivo الوضع ، والتفاعلات الخلية الخلية. ومع ذلك ، يجب على المرء أيضا أن يكون على بينة من القيود المفروضة على هذا النظام ، مثل عدم وجود مكون الأوعية الدموية / الجهاز الجهازي ، والجهاز المناعي الوظيفي أو العصبي ، ويمثل النظام نهجا اختزاليا بالمقارنة مع النماذج الحيوانية. في الواقع ، على النقيض من النماذج الحيوانية ، لا توفر الهياكل ثلاثية الأبعاد سوى تقريب البيولوجيا داخل جسم الإنسان. قد يساعد فهم قيود الطريقة ثلاثية الأبعاد الباحثين على تصميم عمليات أكثر دقة وصالحة لإنتاج كرويدات تمثل جهازا بشكل أفضل على نطاق أوسع23,24,25.
السرطان هو السبب الرئيسي للوفاة في جميع أنحاء العالم، وسرطان الثدي هو السرطان الأكثر شيوعا لدى النساء26،27،28. لمحاكاة البيئة الدقيقة المعقدة لسرطان الثدي، يجب استزراع كرويات سرطان الثدي باستخدام الخلايا التي تلعب دورا بارزا في أورام الثدي، أي الخلايا الظهارية والخلايا البطانية والخلايا الليفية و/أو الخلايا المناعية. وعلاوة على ذلك، بالنسبة للكفرويد الذي يمثل سرطان الثدي، ينبغي أيضا النظر في التعبير عن مستقبلات الهرمونات الأنثوية (مستقبلات هرمون الاستروجين/البروجسترون)، والقدرة على الحفاظ على الحالة النسيجية للورم المريض، والقدرة على محاكاة الاستجابة للعلاج. وقد أظهرت الدراسات أن أنظمة 3D المشاركة في الثقافة لديها تنظيم الخلوية مماثلة لتلك التي من الأنسجة الأولية في الجسم الحي,لديها القدرة على التفاعل في الوقت الحقيقي للمحفزات, ولها مستقبلات الاندروجين وظيفية29,30,31,32. وبالتالي ، يمكن أن يكون نهجا مماثلا مفيدا لمحاكاة ورم الثدي في المختبر. الغرض من البروتوكول الحالي هو إنشاء طريقة جديدة لتوليد كرويدات سرطان الثدي. تستخدم هذه الطريقة خلايا MCF-7 الإيجابية لمستقبلات الإستروجين (خط خلايا بشرية خالدة من الخلايا الظهارية) والخلايا البطانية الوعائية (HUVECs) أو الخلايا البطانية اللمفاوية (HMVEC-DNeo) لإنشاء نموذج يحاكي أو يعكس عن كثب التفاعلات بين هذه الخلايا داخل الورم. على الرغم من أن MCF-7 (الإستروجين استجابة) والخلايا البطانية قد استخدمت لتطوير كرويدات في هذه الدراسة, خلايا أخرى مثل الخلايا الليفية التي تمثل ~ 80٪ من كتلة ورم الثدي, ويمكن أيضا أن تكون مجتمعة في المستقبل لتمثيل أفضل وتقليد ورم الثدي.
هناك عدة طرق لتشكيل كرويدات، مثل: 1) طريقة القطيرات المعلقة التي تستخدم الجاذبية33،34؛ 2) طريقة الارتفاع المغناطيسي الذي يستخدم الجسيمات النانوية المغناطيسية يتعرض لمغناطيس خارجي35، و 3) طريقة لوحة كروية الدقيقة التي يتم تنفيذها من قبل خلايا البذر على لوحات منخفضة المرفق36،37. على أساس الأساليب الموجودة، والتي تستخدم نوع خلية واحدة فقط، وقد تم الأمثل البروتوكول الحالي باستخدام الخلايا الظهارية والظهارية لمحاكاة أفضل لظروف نمو أورام سرطان الثدي في الجسم الحي38،39،40،41. ويمكن تحقيق هذه الطريقة بسهولة في المختبر بتكلفة منخفضة وبأقل قدر من الاحتياجات من المعدات. وبناء على حاجة/أهداف المختبر، استخدمت نهج مختلفة لتشكيل كرويدات والحصول على المواد الخلوية ذات الصلة من هذه الكرويات. في هذا السياق ، بالنسبة لتحليل الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي أو البروتين ، يتم إنتاج كرويدات ثلاثية الأبعاد عن طريق الخلايا البطانية والظهارية المشتركة مع طريقة الإسقاط المعلق. ومع ذلك ، للدراسات الوظيفية ، على سبيل المثال ، لمراقبة نمو الخلايا بعد التدخل القصير (siRNA) العدوى و / أو العلاج الهرموني ، يتم إنشاء كرويدات باستخدام لوحات U-bottom.
الغرض من هذا البروتوكول التقني هو تقديم وصف مفصل خطوة بخطوة ل1) تشكيل سرطان الثدي كرويدات متعددة الخلايا، 2) إعداد عينات لتلطيخ الخلايا النسيجية، و 3) جمع الخلايا لاستخراج الحمض النووي الريبي، الحمض النووي، والبروتينات. يتم استخدام كل من طريقة إسقاط شنقا غير مكلفة ولوحات U-أسفل أكثر تكلفة لتشكيل كرويدات. هنا، يتم توفير بروتوكول لإعداد (تحديد) كرويات للقسم والتلوي المناعي اللاحق مع علامات لتقييم انتشار الخلايا، وموت الخلايا المبرمج، وتوزيع الخلايا الظهارية والظهارية داخل كروية. بالإضافة إلى ذلك، يعرض هذا البروتوكول تحليلا كاملا خطوة بخطوة للبيانات النسيجية باستخدام برنامج ImageJ. يختلف تفسير البيانات البيولوجية حسب نوع التجربة والأجسام المضادة المستخدمة. تم إجراء تقسيم كرويات ثابتة وتلطيخ لاحق للأقسام من قبل مختبر علم الأمراض الروتيني (Sophistolab: info@sophistolab.ch)
بالمقارنة مع ثقافات الخلايا 2D ، فإن تقنية ثقافة كروية ثلاثية الأبعاد الثورية هي أداة أفضل وأكثر قوة لإعادة بناء البيئة الدقيقة للجهاز ، وتفاعلات خلايا الخلية ، واستجابات الدواء في المختبر. هذا هو البروتوكول الأول الذي يصف تشكيل كرويات من خطوط الخلايا المتعددة الخلايا (الظهارية والظ?…
The authors have nothing to disclose.
تم دعم هذا البحث من قبل مؤسسة أبحاث السرطان / منحة الرابطة السويسرية للسرطان KFS-4125-02-2017 إلى RKD ومنحة المعهد الوطني للصحة DK079307 إلى EKJ.
100 mm × 20 mm tissue-culture treated culture dishes | Corning | CLS430167 | |
149MULTI0C1 | |||
35 x 10 mm Tissue Culture Dish | Falcon | 353001 | |
5 mL Serological Pipet, Polystyrene, Individually Packed, Sterile | Falcon | 357543 | |
Adobe Photoshop | Version: 13.0.1 (64-bit) | ||
Antibiotic Antimycotic Solution (100×) | Sigma-Aldrich | A5955 | |
Calcein-AM | Sigma-Aldrich | 17783 | |
CD31 (cluster of differentiation 31) | Cell Marque | 131M-95 | monoclonal mouse ab clone JC70 |
CellTracker Green CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetate) | Invitrogen | C7025 | |
CK8/18 (cytokeratins 8 and 18) | DBS | Mob189-05 | monoclonal mouse ab, clone 5D3 |
CKX41 Inverted Microscope | Olympus Life Science | Olympus DP27 digital camera | |
Cleaved Caspase 3 | Cell Signaling | 9661L | polyclonal rabbit ab |
Collagen (rat tail) | Roche | 11 179 179 001 | |
Coulter ISOTON II Diluent | Beckman Coulter | 844 80 11 | Diluent II |
Coulter Z1, Cell Counter | Coulter Electronics, Luton, UK | ||
Dehydrated Culture Media: Noble Agar | BD Difco | BD 214220 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham | Sigma-Aldrich | D6434 | |
EBM-2 Endothelial Cell Growth Basal Medium-2 | Lonza | 190860 | |
Ethidium homodimer | Sigma-Aldrich | 46043 | |
Fetal Calf Serum (FCS) | Thermo Fisher Scientific | SH30070 | |
Fetal Calf Serum Charcoal Stripped (FCS sf) | Thermo Fisher Scientific | SH3006803 | |
Fluorescence stereo microscopes Leica M205 FA | Leica Microsystems | ||
GlutaMAX Supplement (100x) | Gibco | 35050038 | |
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | Gibco | 14175053 | |
Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | |
HUVEC – Human Umbilical Vein Endothelial Cells | Lonza | CC-2517 | |
ImageJ | National Institute of Health, USA | Wayne Rasband Version: 1.52a (64-bit) |
|
Ki67 | Cell Marque | 275R-16 | monoclonal rabbit ab, clone SP6 |
Leica Histocore Multicut Rotary Microtome | 149MULTI0C1 | ||
Low Serum Growth Supplement Kit (LSGS Kit) | Gibco | S003K | |
MCF-7 cells – human breast adenocarcinoma cell line | Clinic for Gynecology, University Hospital Zurich | Provived from Dr Andrè Fedier obtained from ATCC | |
Nunclon Sphera 96U-well plate | Thermo Fisher Scientific | 174925 | |
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148 | |
Phosphate-buffered saline (PBS) 1x | Gibco | 10010015 | |
Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
Protein Lysis Buffer | Cell Signaling, Danvers, USA | 9803 | |
Quick-RNA Miniprep Kit | Zymo Research | R1055 | |
RNA Lysis Buffer | Zymo Research | R1060-1-100 | Contents in Quick-RNA Miniprep Kit |
Rotina 46R Centrifuge | Hettich | ||
Round-Bottom Polystyrene Tubes, 5 mL | Falcon | 352003 | |
Sonicator | Bandelin electronics, Berlin, DE | ||
Tecan Infinite series M200 microplate reader | Tecan, Salzburg, AU | ||
Tissue Culture Flasks 75 | TPP | 90076 | |
Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T3924 |