La diafonia tra cellule epiteliali mammarie e cellule endoteliali contribuisce in modo importante alla progressione del cancro al seno, alla crescita del tumore e alle metastasi. In questo studio, gli sferoidi sono stati realizzati da cellule di cancro al seno insieme a cellule endoteliali vascolari e / o linfatiche e dimostrano la loro applicabilità come sistema in vitro per la ricerca sul cancro al seno.
Il cancro al seno è la principale causa di mortalità nelle donne. La crescita delle cellule del cancro al seno e le loro successive metastasi è un fattore chiave per la sua progressione. Sebbene i meccanismi coinvolti nella promozione della crescita del cancro al seno siano stati intensamente studiati utilizzando monocolture di cellule di cancro al seno come le cellule MCF-7, il contributo di altri tipi di cellule, come le cellule endoteliali vascolari e linfatiche che sono intimamente coinvolte nella crescita del tumore, non è stato studiato in profondità. L’interazione cellula-cellula svolge un ruolo chiave nella crescita e nella progressione del tumore. La neoangiogenesi, o lo sviluppo dei vasi, è essenziale per la crescita del tumore, mentre il sistema linfatico funge da portale per la migrazione delle cellule tumorali e le successive metastasi. Studi recenti forniscono la prova che le cellule endoteliali vascolari e linfatiche possono influenzare significativamente la crescita delle cellule tumorali. Queste osservazioni implicano la necessità di sviluppare modelli in vitro che riflettano più realisticamente i processi di crescita del cancro al seno in vivo. Inoltre, le restrizioni nella ricerca sugli animali richiedono lo sviluppo di modelli ex vivo per chiarire meglio i meccanismi coinvolti.
Questo articolo descrive lo sviluppo di sferoidi del cancro al seno composti sia da cellule di cancro al seno (cellule MCF-7 positive al recettore degli estrogeni) che da cellule endoteliali vascolari e / o linfatiche. Il protocollo descrive un approccio dettagliato passo-passo nella creazione di sferoidi a doppia cella utilizzando due diversi approcci, hanging drop (gold standard ed economico) e piastre a U a 96 pozzetti (costose). Vengono fornite istruzioni approfondite su come raccogliere delicatamente gli sferoidi formati per monitorare la crescita mediante dimensionamento microscopico e valutazione della vitalità utilizzando la colorazione di cellule morte e vive. Inoltre, vengono delineate le procedure per fissare gli sferoidi per il sezionamento e la colorazione con anticorpi specifici della crescita per differenziare i modelli di crescita negli sferoidi. Inoltre, vengono forniti dettagli per la preparazione di sferoidi con cellule trasfettate e metodi per estrarre l’RNA per l’analisi molecolare. In conclusione, questo articolo fornisce istruzioni approfondite per la preparazione di sferoidi multicellulari per la ricerca sul cancro al seno.
L’uso di animali per esperimenti ha dei limiti. Gli studi sugli animali non possono imitare accuratamente la progressione della malattia negli esseri umani e gli animali e gli esseri umani non hanno risposte identiche agli agenti patogeni. Inoltre, le restrizioni nella sperimentazione animale a causa delle preoccupazioni per la sofferenza degli animali e dei problemi etici1,2 vincolano sempre più i programmi di ricerca. In vitro sono stati ampiamente sviluppati sistemi per eludere l’uso degli animali; inoltre, l’uso di cellule umane ha reso in vitro modelli più rilevanti per l’indagine fisiopatologica e terapeutica. Le colture cellulari monostrato convenzionali (2D) sono ampiamente utilizzate perché imitano i tessuti umani in una certa misura. Tuttavia, le monocolture 2D non riescono a imitare gli organi umani e le monocolture 2D non sono in grado di simulare il complesso microambiente degli organi originali e imitare il in vivo situazione3,4,5,6. Inoltre, nelle colture cellulari monostrato, i trattamenti farmacologici potrebbero facilmente distruggere / danneggiare tutte le cellule. È importante sottolineare che alcune di queste limitazioni possono essere superate passando a colture cellulari tridimensionali multistrato (3D)7,8. In effetti, i modelli di coltura 3D hanno dimostrato di riflettere meglio la struttura cellulare, il layout e la funzione delle cellule nei tessuti primari. Queste colture 3D possono essere formate utilizzando una varietà di linee cellulari, simili a un organo funzionale. In effetti, ci sono due modelli di culture 3D. Un modello produce sferoidi di cellule aggregate che formano cluster e li riorganizzano in sfere (modelli senza impalcature). Il secondo produce organoidi, che hanno una struttura più complessa e consistono in combinazioni di più cellule specifiche dell’organo, che sono considerate come una versione in miniatura degli organi9,10. Per questo motivo, i sistemi di coltura 3D rappresentano una tecnologia innovativa con molte applicazioni biologiche e cliniche. Pertanto, gli sferoidi e gli organoidi hanno numerose applicazioni per la modellazione delle malattie e gli studi relativi alla medicina rigenerativa, allo screening dei farmaci e agli studi tossicologici.6,11,12,13,14,15. Gli sferoidi cancerogeni, derivati dalla tecnologia 3D, ricreano la morfologia e il fenotipo dei tipi cellulari rilevanti, imitano il in vivo microambiente tumorale e modelli di comunicazioni cellulari e vie di segnalazione che sono operative durante lo sviluppo del tumore16,17,18. Inoltre, per migliorare la comprensione della biologia del cancro, gli sferoidi / organoidi tumorali possono anche essere utilizzati per identificare una potenziale terapia antitumorale specifica per il paziente (personalizzata) e valutarne l’efficacia, la tossicità e gli effetti a lungo termine19,20,21,22. Gli sferoidi hanno aperto importanti opportunità per studiare la fisiopatologia, la modellazione delle malattie e lo screening dei farmaci a causa della loro capacità di preservare l’architettura dei tessuti cellulari e tridimensionali, la capacità di imitare il in vivo e le interazioni cellula-cellula. Tuttavia, si deve anche essere consapevoli dei limiti di questo sistema, come la mancanza di componente vascolare / sistemica, sistema immunitario funzionale o nervoso, e il sistema rappresenta un approccio riduzionista rispetto ai modelli animali. Infatti, a differenza dei modelli animali, le strutture 3D forniscono solo un’approssimazione della biologia all’interno di un corpo umano. Comprendere i limiti del metodo 3D può aiutare i ricercatori a progettare processi più raffinati e validi per la produzione di sferoidi che rappresentino meglio un organo su scala più ampia.23,24,25.
Il cancro è la principale causa di morte in tutto il mondo e il cancro al seno è il cancro più comune nelle donne26,27,28. Per imitare il complesso microambiente del cancro al seno, gli sferoidi del cancro al seno devono essere coltivati utilizzando cellule che svolgono un ruolo di primo piano nei tumori al seno, cioè cellule epiteliali, cellule endoteliali, fibroblasti e / o cellule immunitarie. Inoltre, per uno sferoide che rappresenta il cancro al seno, dovrebbero essere prese in considerazione anche l’espressione dei recettori ormonali femminili (recettori degli estrogeni / progesterone), la capacità di conservare lo stato istologico del tumore del paziente e la capacità di imitare la risposta alla terapia. Gli studi hanno dimostrato che i sistemi di co-coltura 3D hanno un’organizzazione cellulare simile a quella del tessuto primario in vivo,hanno la capacità di reagire in tempo reale agli stimoli, e hanno recettori androgeni funzionali29,30,31,32. Quindi, un approccio simile potrebbe essere utile per imitare un tumore al seno in vitro. Lo scopo dell’attuale protocollo è quello di stabilire un nuovo metodo per generare sferoidi del cancro al seno. Questo metodo utilizza cellule MCF-7 positive al recettore degli estrogeni (una linea cellulare umana immortalizzata di cellule epiteliali) e cellule endoteliali vascolari (HUVEC) o cellule endoteliali linfatiche (HMVEC-DNeo) per creare un modello che imita o riflette da vicino le interazioni tra queste cellule all’interno di un tumore. Sebbene MCF-7 (estrogeno-responsivo) e cellule endoteliali siano state utilizzate per sviluppare sferoidi nel presente studio, altre cellule come i fibroblasti che rappresentano circa l’80% della massa tumorale al seno, potrebbero anche essere combinate in futuro per rappresentare e imitare meglio il tumore al seno.
Esistono diversi metodi per formare sferoidi, come: 1) il metodo delle goccioline appese che impiega la gravità33,34; 2) il metodo di levitazione magnetica che utilizza nanoparticelle magnetiche esposte ad un magnete esterno35,e 3) il metodo delle micropiastre sferoidi che viene eseguito seminando cellule su piastre a basso attacco36,37. Sulla base dei metodi esistenti, che utilizzano un solo tipo di cellula, il presente protocollo è stato ottimizzato utilizzando cellule epiteliali ed endoteliali per imitare meglio le condizioni di crescita dei tumori del cancro al seno in vivo38,39,40,41. Questo metodo può essere facilmente ottenuto in laboratorio a basso costo e con requisiti minimi di attrezzatura. Sulla base delle necessità / obiettivi del laboratorio, sono stati utilizzati diversi approcci per formare sferoidi e ottenere materiale cellulare rilevante da questi sferoidi. In questo contesto, per l’analisi del DNA, dell’RNA o delle proteine, gli sferoidi 3D sono prodotti co-coltivando cellule endoteliali ed epiteliali con il metodo della goccia sospesa. Tuttavia, per gli studi funzionali, ad esempio, per monitorare la crescita cellulare dopo una breve trasfezione interferente (siRNA) e / o un trattamento ormonale, gli sferoidi vengono generati utilizzando piastre A-fondo.
Lo scopo di questo protocollo tecnico è quello di fornire una descrizione dettagliata passo-passo per 1) formare sferoidi di tipo multicellulare del cancro al seno, 2) preparare campioni per la colorazione istologica e 3) raccogliere cellule per l’estrazione di RNA, DNA e proteine. Sia il metodo economico della goccia sospesa che le piastre più costose con fondo a U vengono utilizzate per formare sferoidi. Qui, viene fornito un protocollo per la preparazione (fissaggio) di sferoidi per il sezionamento e la successiva immunocolorazione con marcatori per valutare la proliferazione cellulare, l’apoptosi e la distribuzione delle cellule epiteliali ed endoteliali all’interno di uno sferoide. Inoltre, questo protocollo mostra un’analisi completa passo-passo dei dati istologici utilizzando il software ImageJ. L’interpretazione dei dati biologici varia a seconda del tipo di esperimento e degli anticorpi utilizzati. Il sezionamento degli sferoidi fissi e la successiva colorazione delle sezioni è stato eseguito da un laboratorio di patologia di routine (Sophistolab: info@sophistolab.ch)
Rispetto alle colture cellulari 2D, la rivoluzionaria tecnologia di coltura sferoide 3D è uno strumento migliore e più potente per ricostruire il microambiente di un organo, le interazioni cellula-cellula e le risposte ai farmaci in vitro. Questo è il primo protocollo che descrive la formazione di sferoidi da linee cellulari multicellulari (epiteliali ed endoteliali) per la ricerca sul cancro al seno. Questo protocollo garantisce la crescita 3D sferoidale degli sferoidi per un massimo di 5 giorni e gli sferoi…
The authors have nothing to disclose.
Questa ricerca è stata sostenuta dalla Cancer Research Foundation / Swiss Cancer League grant KFS-4125-02-2017 a RKD e National Institute of Health grant DK079307 a EKJ.
100 mm × 20 mm tissue-culture treated culture dishes | Corning | CLS430167 | |
149MULTI0C1 | |||
35 x 10 mm Tissue Culture Dish | Falcon | 353001 | |
5 mL Serological Pipet, Polystyrene, Individually Packed, Sterile | Falcon | 357543 | |
Adobe Photoshop | Version: 13.0.1 (64-bit) | ||
Antibiotic Antimycotic Solution (100×) | Sigma-Aldrich | A5955 | |
Calcein-AM | Sigma-Aldrich | 17783 | |
CD31 (cluster of differentiation 31) | Cell Marque | 131M-95 | monoclonal mouse ab clone JC70 |
CellTracker Green CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetate) | Invitrogen | C7025 | |
CK8/18 (cytokeratins 8 and 18) | DBS | Mob189-05 | monoclonal mouse ab, clone 5D3 |
CKX41 Inverted Microscope | Olympus Life Science | Olympus DP27 digital camera | |
Cleaved Caspase 3 | Cell Signaling | 9661L | polyclonal rabbit ab |
Collagen (rat tail) | Roche | 11 179 179 001 | |
Coulter ISOTON II Diluent | Beckman Coulter | 844 80 11 | Diluent II |
Coulter Z1, Cell Counter | Coulter Electronics, Luton, UK | ||
Dehydrated Culture Media: Noble Agar | BD Difco | BD 214220 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham | Sigma-Aldrich | D6434 | |
EBM-2 Endothelial Cell Growth Basal Medium-2 | Lonza | 190860 | |
Ethidium homodimer | Sigma-Aldrich | 46043 | |
Fetal Calf Serum (FCS) | Thermo Fisher Scientific | SH30070 | |
Fetal Calf Serum Charcoal Stripped (FCS sf) | Thermo Fisher Scientific | SH3006803 | |
Fluorescence stereo microscopes Leica M205 FA | Leica Microsystems | ||
GlutaMAX Supplement (100x) | Gibco | 35050038 | |
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | Gibco | 14175053 | |
Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | |
HUVEC – Human Umbilical Vein Endothelial Cells | Lonza | CC-2517 | |
ImageJ | National Institute of Health, USA | Wayne Rasband Version: 1.52a (64-bit) |
|
Ki67 | Cell Marque | 275R-16 | monoclonal rabbit ab, clone SP6 |
Leica Histocore Multicut Rotary Microtome | 149MULTI0C1 | ||
Low Serum Growth Supplement Kit (LSGS Kit) | Gibco | S003K | |
MCF-7 cells – human breast adenocarcinoma cell line | Clinic for Gynecology, University Hospital Zurich | Provived from Dr Andrè Fedier obtained from ATCC | |
Nunclon Sphera 96U-well plate | Thermo Fisher Scientific | 174925 | |
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148 | |
Phosphate-buffered saline (PBS) 1x | Gibco | 10010015 | |
Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
Protein Lysis Buffer | Cell Signaling, Danvers, USA | 9803 | |
Quick-RNA Miniprep Kit | Zymo Research | R1055 | |
RNA Lysis Buffer | Zymo Research | R1060-1-100 | Contents in Quick-RNA Miniprep Kit |
Rotina 46R Centrifuge | Hettich | ||
Round-Bottom Polystyrene Tubes, 5 mL | Falcon | 352003 | |
Sonicator | Bandelin electronics, Berlin, DE | ||
Tecan Infinite series M200 microplate reader | Tecan, Salzburg, AU | ||
Tissue Culture Flasks 75 | TPP | 90076 | |
Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T3924 |