Дендритные шипы являются важными клеточными особенностями нервной системы. Здесь описаны методы визуализации в реальном времени для оценки структуры и функции дендритных шипов у C. elegans. Эти подходы поддерживают разработку мутантных экранов для генов, которые определяют форму или функцию дендритного позвоночника.
Дендритные шипы являются специализированными участками синаптической иннервации, модулированной активностью, и служат субстратами для обучения и памяти. Недавно дендритные шипы были описаны для DD GABAergic нейронов как входные участки от пресинаптических холинергических нейронов в двигательном контуре Caenorhabditis elegans. Эта синаптическая схема теперь может служить мощной новой моделью морфогенеза и функции позвоночника in vivo , которая использует поверхностную генетику и доступность C. элеганс к визуализации живых клеток.
Этот протокол описывает экспериментальные стратегии оценки структуры и функции позвоночника DD. В этом подходе стратегия визуализации со сверхвысоким разрешением используется для визуализации сложных форм дендритных шипов, богатых актинами. Чтобы оценить функцию позвоночника DD, активированный светом опсин, Chrimson, стимулирует пресинаптические холинергические нейроны, а индикатор кальция, GCaMP, сообщает о вызванных переходных процессах кальция в постсинаптических шипах DD. Вместе эти методы включают в себя мощные подходы к выявлению генетических детерминант дендритных шипов у C. elegans , которые также могут направлять морфогенез и функцию позвоночника в мозге.
Дендритные шипы являются специализированными клеточными структурами, которые получают входные данные от соседних нейронов для синаптической передачи. Активация рецепторов нейротрансмиттеров повышает внутриклеточный кальций и нисходящие сигнальные пути в этих характерных нейронных протрузиях1. Из-за фундаментального значения дендритных шипов для нейротрансмиссии и их неправильной регуляции при заболеваниях нервного развития1, открытие факторов, модулирующих дендритный морфогенез и функцию позвоночника, представляет высокий интерес для области неврологии.
Недавно дендритные шипы были идентифицированы в нервной системе C. elegans на основе ключевых характеристик, общих с шипами млекопитающих2. Это определение имеет решающее значение, потому что оно открывает возможность использования преимуществ C. elegans для исследования биологии позвоночника. Дендритные шипы на дорсальных D (DD) двигательных нейронах получают входные данные от холинергических нейронов (VA и VB) в вентральном нервном канатике (рисунок 1A)2,3,4. Здесь представлены методы визуализации для изучения структуры дендритных шипов DD и их функции in vivo в неповрежденной нервной системе, которая легко доступна для живой визуализации и генетического анализа. Для контроля формы дендритных шипов, (1) цитозольных флуоресцентных белков, которые заполняют дендритный отросток и шипы; (2) мембранно-связанные флуоресцентные белки, которые украшают границу дендритных шипов и дендритов; или (3) используются актиновые маркеры, LifeAct5 или Utrophin6, которые обогащены дендритными шипами, тем самым выявляя их форму. Для мониторинга функциональности шипов DD флуоресценция GCaMP используется для обнаружения переходных процессов Ca++, вызванных активацией опсина с красным смещением, Chrimson, в пресинаптических холинергических нейронах7. Ожидается, что обе стратегии облегчат изучение дендритных шипов DD у диких и мутантных животных.
Детектор Airyscan был выбран для получения снимков шипов DD, потому что он обеспечивает более высокое отношение сигнал/шум и лучшее разрешение, чем обычные конфокальные микроскопы19,20. Визуализация AiryScan также позволяет использовать обычные флуоресцентные белки (например, GFP, mCherry и т. Д.), В настоящее время широко доступные для C. elegans. Хотя изображения с более высоким разрешением могут быть получены с помощью других методов сверхвысокого разрешения (например, STORM, STED, PALM), для этих методов требуются фотоактивируемые или фотопереключаемые флуоресцентные белки21. В качестве альтернативы Airyscan рекомендуются обычные конфокальные микроскопы. Например, визуализация с помощью захвата Найквиста (рисунок 3) достигает размера пикселя с использованием объектива 40x/1.3 123,9 нм, достаточного для различения морфологических типов позвоночника (рисунок 2).
Для определения плотности позвоночника рекомендуется использовать цитозольный флуоресцентный белок, такой как (1) mCherry или GFP, (2) LifeAct для маркировки актинового цитоскелета или (3) миритоилированный флуоресцентный белок (например, MYR::mRuby) для маркировки плазматической мембраны (рисунок 1B). Для сравнения, F-актин-связывающий белок Утрофин снижает плотность позвоночника (Рисунок 1С), что указывает на негативное влияние на морфогенез позвоночника при чрезмерной экспрессии Утрофина.
Современные методы визуализации должны помочь идентифицировать генетические варианты, которые управляют морфологией позвоночника 1,16. Морфология позвоночника DD (т.е. тонкий/грибной, филоподиальный, короткий, разветвленный, см. Рисунок 2) может быть оценена по одиночным 2D-проекциям боковых изображений спинного мозга вентрального нерва, поскольку большинство шипов DD принимают характерно вентрально направленную ориентацию. В этих сравнениях важно использовать один и тот же флуоресцентный маркер для каждого состояния, поскольку кажущиеся морфологические типы позвоночника, по-видимому, зависят от метода маркировки (например, MYR::mRuby vs. LifeAct::GFP). Кроме того, было отмечено, что формы позвоночника динамичны и, вероятно, меняют форму в ответ на внешние сигналы 2,16. Таким образом, также важно сравнивать формы позвоночника между генотипами на одинаковых стадиях развития и в аналогичных условиях.
Ориентация вентрального шнура C. elegans критически важна для точного получения изображения. Как вентральный, так и спинной шнуры на противоположных сторонах животного должны быть видны в одной Z-плоскости, что указывает на то, что червь ориентирован на бок (рисунок 1B). Лучше всего не собирать изображения червей, движущихся или контактирующих с другими червями или пузырьками вблизи вентрального шнура, так как это может ухудшить изображения шипов.
Для визуализации кальция in vivo свежие слайды должны быть подготовлены непосредственно перед каждым приобретением. Лучше всего изображать червей, контактирующих только с тонкими клеевыми волокнами против. «шарики» клея, которые имеют тенденцию высушивать червей и ухудшать изображение (рисунок 4B). В эксперименте, показанном на рисунке 4, импульс света 561 нм активирует все поле зрения. Для увеличения временного и пространственного разрешения для обнаружения локальных переходных процессов Ca++ , например, в пределах отдельных шипов DD, мини-сканер galvo, настроенный для лазерной линии 561 нм, может быть использован для стимуляции меньшей области интереса17.
The authors have nothing to disclose.
Визуализация и анализ на Imaris были выполнены в общем ресурсе визуализации клеток Вандербильта (CIRS), поддерживаемом NIH (CA68485, DK20593, DK58404, DK59637 и EY08126). LSM 880 поддерживается грантом 1S10OD201630. Создание изображений на вращающемся диске Nikon выполнялось в Центре передового опыта Nikon. Мы благодарим Дженни Шафер, директора CISR, и Брайана Миллиса за обучение и проницательные дискуссии, а также членов лаборатории Burnette: Дилана Бернетта, Эйдана Феникса и Нилая Танеджу за советы. Эта работа была поддержана грантами Национальных институтов здравоохранения для DMM (R01NS081259 и R01NS106951) и грантом Американской кардиологической ассоциации ACC (18PRE33960581).
All-trans retinal (ATR) | Sigma-Aldrich | R2500-100MG | Necessary cofactor for neuronal excitation with Chrimson |
diH2O | MilliQ | To prepare M9 buffer | |
Ethanol 100% | Sigma | 64-17-5 | To dilute ATR and make control plates for neuronal excitation |
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (tricaine) | To immobilize animals for imaging dendritic spines | ||
ImageJ | NIH | (Schindelin J et al., 2012) | Open source image processing software |
KH2PO4 | Fisher Bioreagents | 7758-11-4 | To prepare M9 buffer |
Levamisole hydrochloride | Sigma | 16595-80-5 | To immobilize animals for imaging dendritic spines |
MgSO4 | Fisher Chemical | M63-500 | To prepare M9 buffer |
Microscope cover glass | Fisherbrand | 12542B | To mount animals for microscopy acquisition |
Na2HPO4 | Fisher Scientific | S369-500 | To prepare M9 buffer |
NaCl | Fisher Chemical | S671-3 | To prepare M9 buffer |
NIS Elements version 05.21 | Nikon | To analyze images and movies (e.g., Deconvolution, image alignment) | |
Polybeads carboxylate 0.05um microspheres | Polysciences, Inc | 15913-10 | To immobilize animals for imaging Ca++ transients |
Prism | For statistical analysis and graphing normalized Ca++ transients | ||
SeaKen ME agarose | Lonza | 50014 | To make agarose pads to mount animals for imaging |
Super Glue | The gorilla company | To immobilize animals for imaging Ca++ transients | |
Superfrost microscope slides | Fisherbrand | 22-034-980 | To mount animals for microscopy acquisition |
vaseline | Covidien | 8884430300 | To seal sample for confocal snapshots |
Wax | Fisherbrand | 23-021-399 | Paraplast tissue embedding medium |
Microscope for super-resolution imaging | |||
LSM880 | Zeiss | ||
AiryScan detector | Zeiss | ||
Plan Apochromat (oil) 63x/ 1.40 NA, WD = 0.19 mm | |||
Laser lines | |||
Stage controller | |||
Microscope for Nyquist image acquisition | |||
A1R Confocal | Nikon | ||
Plan Fluor (oil) 40x/1.3 NA, WD 0.24 mm | |||
488 nm, 16mW | |||
561 nm, 17mW | |||
Microscope to monitor evoked Ca++ transients in dendritic spines | |||
Spinning Disk Confocal | Nikon | ||
Andor DU-897 EMCCD camera | |||
Spinning disk Head CSU-X1 | Yokogawa | ||
Apo TIRF (oil) 100x/1.49 NA ,WD 0.12 mm | |||
488 nm, 65mW | |||
561 nm, 86mW | |||
525 nm (+/- 18 nm) | |||
605 nm (+/- 35 nm) |