As espinhas dendríticas são características celulares importantes do sistema nervoso. Aqui são descritos métodos de imagem vivos para avaliar a estrutura e a função dos espinhos dendríticos em C. elegans. Essas abordagens apoiam o desenvolvimento de telas mutantes para genes que definem a forma ou a função da coluna dendrítica.
Os espinhos dendríticos são locais especializados de inervação sináptica modulados pela atividade e servem como substratos para a aprendizagem e a memória. Recentemente, espinhas dendríticas têm sido descritas para neurônios DD GABAérgicos como os locais de entrada de neurônios colinérgicos pré-sinápticos no circuito motor de Caenorhabditis elegans. Este circuito sináptico pode agora servir como um novo e poderoso modelo in vivo de morfogênese e função da coluna vertebral que explora a genética fácil e a pronta acessibilidade do C. elegans para imagens de células vivas.
Este protocolo descreve estratégias experimentais para avaliar a estrutura e a função da coluna vertebral DD. Nesta abordagem, uma estratégia de imagem de super-resolução é usada para visualizar as formas intrincadas de espinhas dendríticas ricas em actina. Para avaliar a função da coluna vertebral DD, a opsina ativada pela luz, Chrimson, estimula os neurônios colinérgicos pré-sinápticos, e o indicador de cálcio, GCaMP, relata os transientes de cálcio evocados em espinhas DD pós-sinápticas. Juntos, esses métodos compreendem abordagens poderosas para identificar determinantes genéticos de espinhos dendríticos em C. elegans que também poderiam direcionar a morfogênese e a função da coluna vertebral no cérebro.
As espinhas dendríticas são estruturas celulares especializadas que recebem entrada de neurônios vizinhos para transmissão sináptica. A ativação de receptores de neurotransmissores eleva o cálcio intracelular e as vias de sinalização a jusante nessas saliências neuronais características1. Devido à importância fundamental das espinhas dendríticas para a neurotransmissão e sua desregulação nas doenças do neurodesenvolvimento1, a descoberta de fatores que modulam a morfogênese e a função da coluna dendrítica é de alto interesse para o campo da neurociência.
Recentemente, espinhos dendríticos foram identificados no sistema nervoso de C. elegans com base em características-chave compartilhadas com espinhos de mamíferos2. Essa determinação é crucial porque abre a possibilidade de explorar as vantagens de C. elegans para investigar a biologia da coluna. Espinhos dendríticos em neurônios motores Dorsal D (DD) recebem entrada de neurônios colinérgicos (VA e VB) no cordão nervoso ventral (Figura 1A)2,3,4. Aqui, métodos de imagem são apresentados para explorar a estrutura dos espinhos dendríticos DD e sua função in vivo em um sistema nervoso intacto que é prontamente acessível a imagens vivas e análises genéticas. Para monitorar a forma das espinhas dendríticas, (1) proteínas fluorescentes citosólicas, que preenchem o processo dendrítico e os espinhos; (2) proteínas fluorescentes ligadas à membrana, que decoram a borda de espinhos dendríticos e dendritos; ou (3) são utilizados os marcadores de actina, LifeAct5 ou Utrophin6, que são enriquecidos em espinhos dendríticos, revelando assim a sua forma. Para monitorar a funcionalidade das espinhas DD, a fluorescência GCaMP é usada para detectar transientes Ca++ evocados pela ativação da opsina desviada para o vermelho, Chrimson, em neurônios colinérgicos pré-sinápticos7. Espera-se que ambas as estratégias facilitem o estudo de espinhos dendríticos DD em animais selvagens e mutantes.
O detector Airyscan foi selecionado para adquirir instantâneos de espinhos DD por proporcionar maior relação sinal-ruído e melhor resolução do que os microscópios confocais convencionais19,20. A imagem AiryScan também permite o uso de proteínas fluorescentes convencionais (por exemplo, GFP, mCherry, etc.), agora amplamente disponíveis para C. elegans. Embora imagens de maior resolução possam ser obtidas com outros métodos de super-resolução (por exemplo, STORM, STED, PALM), esses métodos requerem proteínas fluorescentes fotoativáveis ou fotocomutáveis21. Como alternativa ao Airyscan, recomendam-se microscópios confocais convencionais. Por exemplo, a imagem com aquisição de Nyquist (Figura 3) atinge o tamanho do pixel usando um objetivo de 40x/1,3 de 123,9 nm, suficiente para distinguir os tipos morfológicos da coluna vertebral (Figura 2).
Para determinar a densidade da coluna, recomenda-se o uso de uma proteína fluorescente citosólica como (1) mCherry ou GFP, (2) LifeAct para marcar o citoesqueleto de actina ou (3) uma proteína fluorescente miristoilada (por exemplo, MYR::mRuby) para marcar a membrana plasmática (Figura 1B). Em comparação, a proteína de ligação à actina F Utrophin reduz a densidade da coluna vertebral (Figura 1C), indicando um efeito negativo na morfogênese da coluna vertebral quando a Utrophin é superexpressa.
Os métodos de imagem atuais devem ajudar a identificar variantes genéticas que regem a morfologia da coluna vertebral 1,16. A morfologia da coluna DD (isto é, fina/cogumelo, filopodial, teimosa, ramificada, ver Figura 2) pode ser avaliada a partir de projeções 2D únicas das imagens laterais da medula nervosa ventral, uma vez que a maioria das espinhas DD adota uma orientação caracteristicamente direcionada ventralmente. Nessas comparações, é essencial usar o mesmo marcador fluorescente para cada condição, uma vez que os tipos morfológicos aparentes da coluna vertebral parecem ser influenciados pelo método de marcação (por exemplo, MYR::mRuby vs. LifeAct::GFP). Além disso, observou-se que as formas da coluna vertebral são dinâmicas e provavelmente mudam de forma em resposta aos sinais externos 2,16. Assim, também é essencial comparar as formas da coluna vertebral entre genótipos em estágios de desenvolvimento semelhantes e em condições semelhantes.
A orientação do cordão ventral de C. elegans é criticamente vital para a aquisição precisa da imagem. Tanto os cordões ventrais quanto os dorsais em lados opostos do animal devem ser visíveis no mesmo plano Z, indicando que o verme está orientado de lado (Figura 1B). É melhor não coletar imagens de vermes em movimento ou em contato com outros vermes ou bolhas perto do cordão ventral, pois isso pode degradar imagens de espinhos.
Para imagens de cálcio in vivo, as lâminas frescas precisam ser preparadas imediatamente antes de cada aquisição. É melhor criar imagens de vermes em contato apenas com fibras de cola finas vs. “bolhas” de cola que tendem a desidratar vermes e degradar a imagem (Figura 4B). No experimento mostrado na Figura 4, o pulso de luz de 561 nm ativa todo o campo de visão. Para aumentar a resolução temporal e espacial para detectar transientes locais de Ca++ , por exemplo, dentro de espinhos DD individuais, um mini scanner galvo configurado para a linha laser de 561 nm pode ser usado para estimular uma região menor de interesse17.
The authors have nothing to disclose.
A imagem e a análise do Imaris foram realizadas no Vanderbilt Cell Imaging Shared Resource (CIRS) suportado pelo NIH (CA68485, DK20593, DK58404, DK59637 e EY08126). O LSM 880 é suportado pela concessão 1S10OD201630. A imagem em um disco giratório Nikon foi realizada no Centro de Excelência Nikon. Agradecemos a Jenny Schafer, diretora do CISR, e a Bryan Millis pelo treinamento e discussões perspicazes e aos membros do laboratório de Burnette: Dylan Burnette, Aidan Fenix e Nilay Taneja por conselhos. Este trabalho foi apoiado por subsídios do National Institutes of Health para DMM (R01NS081259 e R01NS106951) e uma doação da American Heart Association para ACC (18PRE33960581).
All-trans retinal (ATR) | Sigma-Aldrich | R2500-100MG | Necessary cofactor for neuronal excitation with Chrimson |
diH2O | MilliQ | To prepare M9 buffer | |
Ethanol 100% | Sigma | 64-17-5 | To dilute ATR and make control plates for neuronal excitation |
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (tricaine) | To immobilize animals for imaging dendritic spines | ||
ImageJ | NIH | (Schindelin J et al., 2012) | Open source image processing software |
KH2PO4 | Fisher Bioreagents | 7758-11-4 | To prepare M9 buffer |
Levamisole hydrochloride | Sigma | 16595-80-5 | To immobilize animals for imaging dendritic spines |
MgSO4 | Fisher Chemical | M63-500 | To prepare M9 buffer |
Microscope cover glass | Fisherbrand | 12542B | To mount animals for microscopy acquisition |
Na2HPO4 | Fisher Scientific | S369-500 | To prepare M9 buffer |
NaCl | Fisher Chemical | S671-3 | To prepare M9 buffer |
NIS Elements version 05.21 | Nikon | To analyze images and movies (e.g., Deconvolution, image alignment) | |
Polybeads carboxylate 0.05um microspheres | Polysciences, Inc | 15913-10 | To immobilize animals for imaging Ca++ transients |
Prism | For statistical analysis and graphing normalized Ca++ transients | ||
SeaKen ME agarose | Lonza | 50014 | To make agarose pads to mount animals for imaging |
Super Glue | The gorilla company | To immobilize animals for imaging Ca++ transients | |
Superfrost microscope slides | Fisherbrand | 22-034-980 | To mount animals for microscopy acquisition |
vaseline | Covidien | 8884430300 | To seal sample for confocal snapshots |
Wax | Fisherbrand | 23-021-399 | Paraplast tissue embedding medium |
Microscope for super-resolution imaging | |||
LSM880 | Zeiss | ||
AiryScan detector | Zeiss | ||
Plan Apochromat (oil) 63x/ 1.40 NA, WD = 0.19 mm | |||
Laser lines | |||
Stage controller | |||
Microscope for Nyquist image acquisition | |||
A1R Confocal | Nikon | ||
Plan Fluor (oil) 40x/1.3 NA, WD 0.24 mm | |||
488 nm, 16mW | |||
561 nm, 17mW | |||
Microscope to monitor evoked Ca++ transients in dendritic spines | |||
Spinning Disk Confocal | Nikon | ||
Andor DU-897 EMCCD camera | |||
Spinning disk Head CSU-X1 | Yokogawa | ||
Apo TIRF (oil) 100x/1.49 NA ,WD 0.12 mm | |||
488 nm, 65mW | |||
561 nm, 86mW | |||
525 nm (+/- 18 nm) | |||
605 nm (+/- 35 nm) |