Le spine dendritiche sono importanti caratteristiche cellulari del sistema nervoso. Qui vengono descritti metodi di imaging dal vivo per valutare la struttura e la funzione delle spine dendritiche in C. elegans. Questi approcci supportano lo sviluppo di schermi mutanti per i geni che definiscono la forma o la funzione della colonna vertebrale dendritica.
Le spine dendritiche sono siti specializzati di innervazione sinaptica modulata dall’attività e servono come substrati per l’apprendimento e la memoria. Recentemente, le spine dendritiche sono state descritte per i neuroni DD GABAergici come siti di input dai neuroni colinergici presinaptici nel circuito motorio di Caenorhabditis elegans. Questo circuito sinaptico può ora servire come un nuovo potente modello in vivo della morfogenesi e della funzione della colonna vertebrale che sfrutta la facile genetica e la pronta accessibilità di C. elegans all’imaging di cellule vive.
Questo protocollo descrive le strategie sperimentali per valutare la struttura e la funzione della colonna vertebrale DD. In questo approccio, viene utilizzata una strategia di imaging a super-risoluzione per visualizzare le forme intricate delle spine dendritiche ricche di actina. Per valutare la funzione della colonna vertebrale DD, l’opsina attivata dalla luce, Chrimson, stimola i neuroni colinergici presinaptici e l’indicatore di calcio, GCaMP, riporta i transitori di calcio evocati nelle spine DD postsinaptiche. Insieme, questi metodi comprendono potenti approcci per identificare i determinanti genetici delle spine dendritiche in C. elegans che potrebbero anche dirigere la morfogenesi e la funzione della colonna vertebrale nel cervello.
Le spine dendritiche sono strutture cellulari specializzate che ricevono input dai neuroni vicini per la trasmissione sinaptica. L’attivazione dei recettori dei neurotrasmettitori eleva il calcio intracellulare e le vie di segnalazione a valle in queste caratteristiche protrusioni neuronali1. A causa dell’importanza fondamentale delle spine dendritiche per la neurotrasmissione e la loro errata regolazione nelle malattie dello sviluppo neurologico1, la scoperta di fattori che modulano la morfogenesi e la funzione della colonna vertebrale dendritica è di grande interesse per il campo delle neuroscienze.
Recentemente, sono state identificate spine dendritiche nel sistema nervoso di C. elegans sulla base di caratteristiche chiave condivise con le spine dei mammiferi2. Questa determinazione è cruciale perché apre la possibilità di sfruttare i vantaggi di C. elegans per studiare la biologia della colonna vertebrale. Le spine dendritiche sui motoneuroni dorsali D (DD) ricevono input dai neuroni colinergici (VA e VB) nel cordone nervoso ventrale (Figura 1A)2,3,4. Qui, vengono presentati metodi di imaging per esplorare la struttura delle spine dendritiche DD e la loro funzione in vivo in un sistema nervoso intatto che è facilmente accessibile all’imaging dal vivo e all’analisi genetica. Per il monitoraggio della forma delle spine dendritiche, (1) proteine fluorescenti citosoliche, che riempiono il processo dendritico e le spine; (2) proteine fluorescenti legate alla membrana, che decorano il bordo delle spine dendritiche e dei dendriti; o (3) vengono utilizzati i marcatori di actina, LifeAct5 o Utrophin6, che sono arricchiti in spine dendritiche, rivelando così la loro forma. Per monitorare la funzionalità delle spine DD, la fluorescenza GCaMP viene utilizzata per rilevare i transitori Ca++ evocati dall’attivazione dell’opsina spostata verso il rosso, Chrimson, nei neuroni colinergici presinaptici7. Entrambe le strategie dovrebbero facilitare lo studio delle spine dendritiche DD in animali selvatici e mutanti.
Il rivelatore Airyscan è stato selezionato per acquisire istantanee di spine DD perché offre un rapporto segnale-rumore più elevato e una risoluzione migliore rispetto ai microscopi confocali convenzionali 19,20. L’imaging AiryScan consente anche l’uso di proteine fluorescenti convenzionali (ad esempio, GFP, mCherry, ecc.), ora ampiamente disponibili per C. elegans. Sebbene immagini ad alta risoluzione possano essere ottenute con altri metodi di super-risoluzione (ad esempio, STORM, STED, PALM), questi metodi richiedono proteine fluorescenti foto-attivabili o foto-commutabili21. In alternativa ad Airyscan, si raccomandano microscopi confocali convenzionali. Ad esempio, l’imaging con acquisizione Nyquist (Figura 3) raggiunge la dimensione dei pixel utilizzando un obiettivo 40x/1,3 di 123,9 nm, sufficiente a distinguere i tipi morfologici della colonna vertebrale (Figura 2).
Per determinare la densità della colonna vertebrale, si raccomanda di utilizzare una proteina fluorescente citosolica come (1) mCherry o GFP, (2) LifeAct per marcare il citoscheletro di actina o (3) una proteina fluorescente miristoilata (ad esempio, MYR::mRuby) per marcare la membrana plasmatica (Figura 1B). In confronto, la proteina legante la F-actina Utrophin riduce la densità della colonna vertebrale (Figura 1C), indicando un effetto negativo sulla morfogenesi della colonna vertebrale quando l’Utrophin è sovraespressa.
Gli attuali metodi di imaging dovrebbero aiutare a identificare le varianti genetiche che governano la morfologia della colonna vertebrale 1,16. La morfologia della colonna vertebrale DD (cioè sottile/fungo, filopodiale, tozza, ramificata, vedi Figura 2) può essere valutata da singole proiezioni 2D delle immagini laterali del cordone nervoso ventrale poiché la maggior parte delle spine DD adotta un orientamento tipicamente diretto ventralmente. In questi confronti, è essenziale utilizzare lo stesso marcatore fluorescente per ogni condizione poiché i tipi morfologici apparenti della colonna vertebrale sembrano essere influenzati dal metodo di etichettatura (ad esempio, MYR::mRuby vs. LifeAct::GFP). Inoltre, è stato notato che le forme della colonna vertebrale sono dinamiche e probabilmente cambiano forma in risposta ai segnali esterni 2,16. Pertanto, è anche essenziale confrontare le forme della colonna vertebrale tra genotipi in fasi di sviluppo simili e in condizioni simili.
L’orientamento del cordone ventrale di C. elegans è fondamentale per un’acquisizione accurata delle immagini. Sia le corde ventrali che dorsali sui lati opposti dell’animale dovrebbero essere visibili nello stesso piano Z, indicando che il verme è orientato su un lato (Figura 1B). È meglio non raccogliere immagini di vermi in movimento o in contatto con altri vermi o bolle vicino al cordone ventrale, poiché ciò può degradare le immagini delle spine.
Per l’imaging del calcio in vivo , i vetrini freschi devono essere preparati immediatamente prima di ogni acquisizione. È meglio visualizzare i vermi a contatto solo con fibre di colla sottili vs. “globi” di colla che tendono a seccare i vermi e degradare l’immagine (Figura 4B). Nell’esperimento mostrato in Figura 4, l’impulso della luce a 561 nm attiva l’intero campo visivo. Per aumentare la risoluzione temporale e spaziale per rilevare transitori Ca++ locali, ad esempio, all’interno di singole spine DD, è possibile utilizzare un mini scanner galvo impostato per la linea laser a 561 nm per stimolare una regione di interesse più piccola17.
The authors have nothing to disclose.
L’imaging e l’analisi su Imaris sono stati eseguiti nella Vanderbilt Cell Imaging Shared Resource (CIRS) supportata da NIH (CA68485, DK20593, DK58404, DK59637 e EY08126). LSM 880 è supportato dalla sovvenzione 1S10OD201630. L’imaging su un disco rotante Nikon è stato eseguito presso il Nikon Center of Excellence. Ringraziamo Jenny Schafer, direttore del CISR, e Bryan Millis per la formazione e le discussioni approfondite e i membri del laboratorio Burnette: Dylan Burnette, Aidan Fenix e Nilay Taneja per i consigli. Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni del National Institutes of Health a DMM (R01NS081259 e R01NS106951) e una sovvenzione dell’American Heart Association ad ACC (18PRE33960581).
All-trans retinal (ATR) | Sigma-Aldrich | R2500-100MG | Necessary cofactor for neuronal excitation with Chrimson |
diH2O | MilliQ | To prepare M9 buffer | |
Ethanol 100% | Sigma | 64-17-5 | To dilute ATR and make control plates for neuronal excitation |
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (tricaine) | To immobilize animals for imaging dendritic spines | ||
ImageJ | NIH | (Schindelin J et al., 2012) | Open source image processing software |
KH2PO4 | Fisher Bioreagents | 7758-11-4 | To prepare M9 buffer |
Levamisole hydrochloride | Sigma | 16595-80-5 | To immobilize animals for imaging dendritic spines |
MgSO4 | Fisher Chemical | M63-500 | To prepare M9 buffer |
Microscope cover glass | Fisherbrand | 12542B | To mount animals for microscopy acquisition |
Na2HPO4 | Fisher Scientific | S369-500 | To prepare M9 buffer |
NaCl | Fisher Chemical | S671-3 | To prepare M9 buffer |
NIS Elements version 05.21 | Nikon | To analyze images and movies (e.g., Deconvolution, image alignment) | |
Polybeads carboxylate 0.05um microspheres | Polysciences, Inc | 15913-10 | To immobilize animals for imaging Ca++ transients |
Prism | For statistical analysis and graphing normalized Ca++ transients | ||
SeaKen ME agarose | Lonza | 50014 | To make agarose pads to mount animals for imaging |
Super Glue | The gorilla company | To immobilize animals for imaging Ca++ transients | |
Superfrost microscope slides | Fisherbrand | 22-034-980 | To mount animals for microscopy acquisition |
vaseline | Covidien | 8884430300 | To seal sample for confocal snapshots |
Wax | Fisherbrand | 23-021-399 | Paraplast tissue embedding medium |
Microscope for super-resolution imaging | |||
LSM880 | Zeiss | ||
AiryScan detector | Zeiss | ||
Plan Apochromat (oil) 63x/ 1.40 NA, WD = 0.19 mm | |||
Laser lines | |||
Stage controller | |||
Microscope for Nyquist image acquisition | |||
A1R Confocal | Nikon | ||
Plan Fluor (oil) 40x/1.3 NA, WD 0.24 mm | |||
488 nm, 16mW | |||
561 nm, 17mW | |||
Microscope to monitor evoked Ca++ transients in dendritic spines | |||
Spinning Disk Confocal | Nikon | ||
Andor DU-897 EMCCD camera | |||
Spinning disk Head CSU-X1 | Yokogawa | ||
Apo TIRF (oil) 100x/1.49 NA ,WD 0.12 mm | |||
488 nm, 65mW | |||
561 nm, 86mW | |||
525 nm (+/- 18 nm) | |||
605 nm (+/- 35 nm) |