Summary

İnsan Embriyonik Kök Hücrelerinden Yönlendirilmiş Hepatosit Benzeri Hücre İndüksiyonu İçin Etkili Bir Yöntem

Published: May 06, 2021
doi:

Summary

Bu makalede, hESC farklılaşması sırasında Activin A ve CHIR99021’in kesin endoderm (DE) olarak sürekli olarak takviye edilmesiyle insan embriyonik kök hücrelerinin (hESC’ ler) fonksiyonel hepatosit benzeri hücrelere (HLC) farklılaştırılması için ayrıntılı bir protokol açıklanmaktadır.

Abstract

İnsan embriyonik kök hücrelerinden (HESC) elde edilen hepatotit benzeri hücrelerin (LC’ ler) potansiyel işlevleri hastalık modelleme ve ilaç tarama uygulamaları için büyük umut vaat ediyor. Burada, hESC’lerin fonksiyonel HLC’lere farklılaştırılması için verimli ve tekrarlanabilir bir yöntem sağlanmaktadır. Endoderm soyunun kurulması, HLC’lere farklılaşmada önemli bir adımdır. Yöntemimizle, hESC farklılaşması sırasında Activin A ve CHIR99021’i sürekli olarak kesin endoderm (DE) olarak destekleyerek, ardından hepatik progenitör hücrelerin üretilmesini ve son olarak tipik hepatosit morfolojisine sahip HLC’leri tamamen tanımlanmış reaktiflerle evre yönünde bir yöntemle düzenleyerek anahtar sinyal yollarını düzenliyoruz. Bu yöntemle üretilen hESC türevi HBC’ler sahne alanına özgü belirteçleri (albümin dahil, HNF4α nükleer reseptör ve sodyum taurokolat kotransporting polipeptid (NTCP)) ve olgun ve fonksiyonel hepatositlerle ilgili özel özellikler gösterir (indocyanine yeşil lekelenme, glikojen depolama, hematoksilin-eozin boyama ve CYP3 aktivitesi dahil) ve karaciğer hastalıkları çalışmasında HLC tabanlı uygulamaların geliştirilmesi için bir platform sağlayabilir.

Introduction

Karaciğer, deoksidasyon, glikojen depolama ve proteinlerin salgılanması ve sentezi dahil olmak üzere çeşitli roller oynayan son derece metabolik bir organdır1. Çeşitli patojenler, ilaçlar ve heredite karaciğerde patolojik değişikliklere neden olabilir ve işlevlerini etkileyebilir2,3. Karaciğerin ana fonksiyonel birimi olarak hepatositler, yapay karaciğer destek sistemlerinde ve ilaç toksisitesinin ortadan kaldırılmasında önemli bir rol oynar. Bununla birlikte, primer insan hepatatositlerinin kaynağı hücre bazlı tedavide ve karaciğer hastalığı araştırmalarında sınırlıdır. Bu nedenle, fonksiyonel insan hepatatlarının yeni kaynaklarının geliştirilmesi, rejeneratif tıp alanında önemli bir araştırma yönüdür. HESC’lerin kurulduğu 1998 yılından bu yana4, hESC’ler üstün farklılaşma potansiyelleri (uygun bir ortamda çeşitli dokulara farklılaşabilirler) ve yüksek derecede kendini yenileyebilmeleri nedeniyle araştırmacılar tarafından yaygın olarak kabul edilmiştir ve böylece biyoartificial karaciğerler, hepatosit transplantasyonu ve hatta karaciğer doku mühendisliği için ideal kaynak hücreler sağlar5.

Şu anda, hepatik farklılaşma verimliliği büyük ölçüde artırılabilir endoderm6. Kök hücrelerin endoderm haline gelen soy farklılaşmasında, dönüşen büyüme faktörü β (TGF-β) sinyalizasyon seviyeleri ve WNT sinyal yolları endoderm oluşum aşamasının düğümündeki temel faktörlerdir. TGF-β ve WNT sinyalizasyonunun üst düzey aktivasyonu endoderm7,8gelişimini teşvik edebilir. Activin A, TGF-β’a ait bir sitokindir. Bu nedenle, Activin A yaygın insan indüklenmiş pluripotent kök hücrelerin endoderm indüksiyonunda kullanılır (hiPSC’ ler) ve hESC9,10. GSK3 serine-threonine protein kinazdır. Araştırmacılar, GSK3β’nin belirli bir inhibitörü olan CHIR99021’in tipik WNT sinyallerini uyarabileceğini ve belirli koşullar altında kök hücre farklılaşmasını teşvik edebildiğine ulaşarak, CHIR99021’in kök hücre farklılaşmasına endoderm 11 , 12,13‘e indükleme potansiyeline sahip olduğunu öne sürmektedir.

Burada, HESC’lerin fonksiyonel HLC’lere farklılaştırılmasını etkili bir şekilde teşvik etmek için etkili ve tekrarlanabilir bir yöntem rapor ediyoruz. Activin A ve CHIR99021’in sıralı ilavesi yaklaşık% 89.7±0.8 SOX17 (DE belirteci) pozitif hücreler üretti. Daha fazla olgunlaştıktan sonra in vitro, bu hücreler hepatik spesifik belirteçleri ifade etti ve hepatosit benzeri morfoloji (hematoksilin-eozin boyama (H & E) ve indocyanine yeşili (ICG), glikojen depolama ve CYP3 aktivitesi gibi işlevler uyguladı. Sonuçlar, hESK’lerin bu yöntemle olgun fonksiyonel HLC’lere başarılı bir şekilde farklılaştırılabileceğini ve karaciğer hastalığına bağlı araştırmalara ve in vitro ilaç taramasına zemin hazırladığını göstermektedir.

Protocol

1. Kök hücre bakımı NOT: Aşağıda açıklanan hücre bakım protokolü, bir yapışan monolayerde tutulan hES03 hücre hattı için geçerlidir. Bu yazıda yer alan aşağıdaki tüm protokoller için hücreler biyolojik bir güvenlik kabini altında ele alınmalıdır. 5x ek ortamı mTesR temel ortamına seyrelterek 1x mTesR kök hücre kültürü ortamı hazırlayın. 5 mL hESC nitelikli Matrigel’i buz üzerinde 5 mL DMEM/F12 ile seyrelterek 30x hESC nitelikli Matri…

Representative Results

HESC’lerden HLC indüksiyonunun şematik diyagramı ve her farklılaşma aşamasının temsili parlak alan görüntüleri Şekil 1’degösterilmiştir. Aşama I’de, kök hücreleri endoderm hücreleri oluşturmaya teşvik etmek için 3 gün boyunca Activin A ve CHIR99021 eklendi. Evre II’de endoderm hücreleri 5 gün boyunca farklılaşma ortamı ile tedavi edildikten sonra hepatik progenitör hücrelere farklılaştı. Evre III’te erken hepatositler HGF ve OSM’de 10 gün sonra olgunlaşmış…

Discussion

Burada, HESC’lerden HLC’leri üç aşamada indükleyen adım adım bir yöntem sunuyoruz. İlk aşamada, Activin A ve CHIR99021 HESC’leri DE’ye ayırt etmek için kullanıldı. İkinci aşamada KO-DMEM ve DMSO, DE’yi hepatik progenitör hücrelere ayırt etmek için kullanıldı. Üçüncü aşamada, hepatik progenitör hücreleri HLC’lere ayırmaya devam etmek için HZM artı HGF, OSM ve hidrokortizon 21-hemisuccinate sodyum tuzu kullanıldı.

Protokol kullanırken aşağıdaki kritik adımla…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (81870432 Ve X.L.Z.’ye 81570567), (P.N.S.’e 81571994) tarafından desteklendi; Guangdong Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı, Çin (No. 2020A1515010054 ila P.N.S.), Li Ka Shing Shantou Üniversitesi Vakfı (No. L1111 2008’den P.N.S.’ye). Shantou Üniversitesi Tıp Fakültesi’nden Prof. Stanley Lin’e faydalı tavsiyeler için teşekkür ederiz.

Materials

2-Mercaptoethanol Sigma M7522 For hepatic progenitor differentiation
488 labeled goat against mouse IgG ZSGB-BIO ZF-0512 For IF,second antibody
488 labeled goat against Rabbit IgG ZSGB-BIO ZF-0516 For IF,second antibody
Accutase Stem Cell Technologies 7920 For cell passage
Activin A peproTech 120-14E For definitive endoderm formation
Anti – Albumin (ALB) Sigma-Aldrich A6684 For IF and WB, primary antibody
Anti – Human Oct4 Abcam Ab19587 For IF, primary antibody
Anti – α-Fetoprotein (AFP) Sigma-Aldrich A8452 For IF and WB, primary antibody
Anti -SOX17 Abcam ab224637 For IF, primary antibody
Anti-Hepatocyte Nuclear Factor 4 alpha (HNF4α) Sigma-Aldrich SAB1412164 For IF, primary antibody
B-27 Supplement Gibco 17504-044 For definitive endoderm formation
BSA Beyotime ST023-200g For cell blocking
CHIR99021 Sigma-Aldrich SML1046 For definitive endoderm formation
DAPI Beyotime C1006 For nuclear staining
DEPC-water Beyotime R0021 For RNA dissolution
DM3189 MCE HY-12071 For definitive endoderm formation
DMEM/F12 Gibco 11320-033 For cell culture
DMSO Sigma-Aldrich D5879 For hepatic progenitor differentiation
DPBS Gibco 14190-144 For cell culture
GlutaMAX Gibco 35050-061 For hepatic progenitor differentiation
H&E staining kit Beyotime C0105S For H&E staining
Hepatocyte growth factor (HGF) peproTech 100-39 For hepatocyte differentiation
HepatoZYME-SFM (HZM) Gibco 17705-021 For hepatocyte differentiation
Hydrocortisone-21-hemisuccinate Sigma-Aldrich H4881 For hepatocyte differentiation
Indocyanine Sangon Biotech A606326 For Indocyanine staining
Knock Out DMEM Gibco 10829-018 For hepatic progenitor differentiation
Knock Out SR Multi-Species Gibco A31815-02 For hepatic progenitor differentiation
Matrigel hESC-qualified Corning 354277 For cell culture
MEM NeAA Gibco 11140-050 For hepatic progenitor differentiation
mTesR 5X Supplement Stem Cell Technologies 85852 For cell culture
mTesR Basal Medium Stem Cell Technologies 85851 For cell culture
Oncostatin (OSM) peproTech 300-10 For hepatocyte differentiation
P450 – CYP3A4 (Luciferin – PFBE) Promega V8901 For CYP450 activity
PAS staining kit Solarbio G1281 For PAS staining
Pen/Strep Gibco 15140-122 For cell differentiation
Peroxidase-Conjugated Goat anti-Mouse IgG ZSGB-BIO ZB-2305 For WB,second antibody
Primary Antibody Dilution Buffer for Western Blot Beyotime P0256 For primary antibody dilution
ReverTraAce qPCR RT Kit TOYOBO FSQ-101 For cDNA Synthesis
RNAiso Plus TaKaRa 9109 For RNA Isolation
RPMI 1640 Gibco 11875093 For definitive endoderm formation
Skim milk Sangon Biotech A600669 For second antibody preparation
SYBR Green Master Mix Thermo Fisher Scientific A25742 For RT-PCR Analysis
Torin2 MCE HY-13002 For definitive endoderm formation
Tween Sigma-Aldrich WXBB7485V For washing buffer preparation

References

  1. Hou, Y., Hu, S., Li, X., He, W., Wu, G. Amino Acid Metabolism in the Liver: Nutritional and Physiological Significance. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1265, 21-37 (2020).
  2. Huang, C., Li, Q., Xu, W., Chen, L. Molecular and cellular mechanisms of liver dysfunction in COVID-19. Discovery Medicine. 30, 107-112 (2020).
  3. Todorovic Vukotic, N., Dordevic, J., Pejic, S., Dordevic, N., Pajovic, S. B. Antidepressants- and antipsychotics-induced hepatotoxicity. Archives of Toxicology. , (2021).
  4. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
  5. Li, Z., et al. Generation of qualified clinical-grade functional hepatocytes from human embryonic stem cells in chemically defined conditions. Cell Death & Disease. 10, 763 (2019).
  6. Rassouli, H., et al. Gene Expression Patterns of Royan Human Embryonic Stem Cells Correlate with Their Propensity and Culture Systems. Cell Journal. 21, 290-299 (2019).
  7. Loh, K. M., et al. Efficient endoderm induction from human pluripotent stem cells by logically directing signals controlling lineage bifurcations. Cell Stem Cell. 14, 237-252 (2014).
  8. Mukherjee, S., et al. Sox17 and beta-catenin co-occupy Wnt-responsive enhancers to govern the endoderm gene regulatory network. Elife. 9, (2020).
  9. Ang, L. T., et al. A Roadmap for Human Liver Differentiation from Pluripotent Stem Cells. Cell Reports. 22, 2190-2205 (2018).
  10. Carpentier, A., et al. Engrafted human stem cell-derived hepatocytes establish an infectious HCV murine model. Journal of Clinical Investigation. 124, 4953-4964 (2014).
  11. Gomez, G. A., et al. Human neural crest induction by temporal modulation of WNT activation. Developmental Biology. 449, 99-106 (2019).
  12. Lee, J., Choi, S. H., Lee, D. R., Kim, D. S., Kim, D. W. Generation of Isthmic Organizer-Like Cells from Human Embryonic Stem Cells. Molecules and Cells. 41, 110-118 (2018).
  13. Matsuno, K., et al. Redefining definitive endoderm subtypes by robust induction of human induced pluripotent stem cells. Differentiation. 92, 281-290 (2016).
  14. Mathapati, S., et al. Small-Molecule-Directed Hepatocyte-Like Cell Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 38, 1-18 (2016).
  15. Hay, D. C., et al. Highly efficient differentiation of hESCs to functional hepatic endoderm requires ActivinA and Wnt3a signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 12301-12306 (2008).
  16. Siller, R., Greenhough, S., Naumovska, E., Sullivan, G. J. Small-molecule-driven hepatocyte differentiation of human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 4, 939-952 (2015).
  17. Yu, J. S., et al. PI3K/mTORC2 regulates TGF-beta/Activin signalling by modulating Smad2/3 activity via linker phosphorylation. Nature Communications. 6, 7212 (2015).
  18. Borowiak, M., et al. Small molecules efficiently direct endodermal differentiation of mouse and human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 4, 348-358 (2009).
  19. Tahamtani, Y., et al. Treatment of human embryonic stem cells with different combinations of priming and inducing factors toward definitive endoderm. Stem Cells and Development. 22, 1419-1432 (2013).
  20. Song, Z., et al. Efficient generation of hepatocyte-like cells from human induced pluripotent stem cells. Cell Research. 19, 1233-1242 (2009).
  21. Sullivan, G. J., et al. Generation of functional human hepatic endoderm from human induced pluripotent stem cells. Hepatology. 51, 329-335 (2010).
  22. Xia, Y., et al. Human stem cell-derived hepatocytes as a model for hepatitis B virus infection, spreading and virus-host interactions. Journal of Hepatology. 66, 494-503 (2017).
  23. Li, S., et al. Derivation and applications of human hepatocyte-like cells. World Journal of Stem Cells. 11, 535-547 (2019).
  24. Ogawa, S., et al. Three-dimensional culture and cAMP signaling promote the maturation of human pluripotent stem cell-derived hepatocytes. Development. 140, 3285-3296 (2013).
  25. Kim, D. E., et al. Prediction of drug-induced immune-mediated hepatotoxicity using hepatocyte-like cells derived from human embryonic stem cells. Toxicology. 387, 1-9 (2017).

Play Video

Cite This Article
Zhou, Q., Xie, X., Zhong, Z., Sun, P., Zhou, X. An Efficient Method for Directed Hepatocyte-Like Cell Induction from Human Embryonic Stem Cells. J. Vis. Exp. (171), e62654, doi:10.3791/62654 (2021).

View Video