כתב יד זה מתאר פרוטוקול מפורט לבידול של תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) לתאים דמויי הפטוציטים תפקודיים (HLCs) על ידי השלמת Activin A ו- CHIR99021 באופן רציף במהלך בידול hESC לאנדודרם סופי (DE).
הפונקציות הפוטנציאליות של תאים דמויי hepatocyte (HLCs) נגזר תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) לקיים הבטחה גדולה עבור מידול מחלות ויישומי סינון תרופות. בתנאי שכאן היא שיטה יעילה הניתנת לשחזור לבידול של hESCs לתוך HLCs פונקציונליים. הקמת שושלת אנדודרם היא צעד מפתח בהבחנה ל- HLCs. בשיטה שלנו, אנו מווסתים את מסלולי האיתות העיקריים על ידי שכשהם רציף Activin A ו- CHIR99021 במהלך בידול hESC לאנדודרם סופי (DE), ואחריו דור של תאי אב כבד, ולבסוף HLCs עם מורפולוגיה hepatocyte טיפוסי בשיטה stagewise עם ריאגנטים מוגדרים לחלוטין. ה- HLCs הנגזרים מ- hESC המיוצרים על-ידי שיטה זו מבטאים סמנים ספציפיים לבמה (כולל אלבומין, קולטן גרעיני HNF4α, ונתרן טאורוכולאט cotransporting פוליפפטיד (NTCP)), ולהראות מאפיינים מיוחדים הקשורים hepatocytes בוגרת ותפקודית (כולל כתמים ירוקים אינדוקיאנין, אחסון גליקוגן, כתמי המטוקסילין-אאוסין ופעילות CYP3), והוא יכול לספק פלטפורמה לפיתוח יישומים מבוססי HLC במחקר של מחלות כבד.
הכבד הוא איבר מטבולי מאוד זה ממלא מספר תפקידים, כולל deoxidation, אחסון גליקוגן, הפרשת סינתזה של חלבונים1. פתוגנים שונים, תרופות ותושיות יכולים לגרום לשינויים פתולוגיים בכבד ולהשפיע על תפקודיו2,3. Hepatocytes, כיחידה הפונקציונלית העיקרית של הכבד, לשחק תפקיד חשוב במערכות תמיכה בכבד מלאכותי חיסול רעילות סמים. עם זאת, המשאב של hepatocytes אנושי ראשוני מוגבל בטיפול מבוסס תאים, כמו גם במחקר מחלות כבד. לכן, פיתוח מקורות חדשים של hepatocytes אנושי תפקודי הוא כיוון מחקר חשוב בתחום הרפואה רגנרטיבית. מאז 1998 כאשר hESCs הוקמו4, hESCs נחשבו נרחב על ידי חוקרים בגלל פוטנציאל הבידול המעולה שלהם (הם יכולים להבדיל לרקמות שונות בסביבה מתאימה) ודרגה גבוהה של חידוש עצמי, ובכך לספק תאי מקור אידיאליים לכבדים ביו-אפיים, השתלת hepatocyte ואפילו הנדסת רקמת כבד5.
נכון לעכשיו, יעילות בידול הכבד ניתן להגדיל מאוד על ידי העשרת endoderm6. בהבחנה שושלת של תאי גזע לתוך endoderm, רמות של גורם הגדילה טרנספורמציה β (TGF-β) איתות מסלולי איתות WNT הם הגורמים העיקריים בצומת של שלב היווצרות endoderm. הפעלה של רמה גבוהה של TGF-β ו WNT איתות יכול לקדם את הפיתוח של endoderm7,8. Activin A הוא ציטוקינים השייכים למשפחה העל TGF-β. לכן, Activin A נמצא בשימוש נרחב אינדוקציה endoderm של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרה אנושי (hiPSCs) ו hESCs9,10. GSK3 הוא קינאז חלבון סרין-טרונין. חוקרים מצאו כי CHIR99021, מעכב ספציפי של GSK3β, יכול לעורר אותות WNT טיפוסי, והוא יכול לקדם בידול תאי גזע בתנאים מסוימים, מה שמרמז כי CHIR99021 יש פוטנציאל לגרימת התמיינות תאי גזע לתוך endoderm 11,12,13.
כאן אנו מדווחים על שיטה יעילה הניתנת לשחזור לגרימת הבידול היעיל של hESCs לתוך HLCs פונקציונליים. התוספת הרציפה של Activin A ו- CHIR99021 ייצרה כ 89.7±0.8% SOX17 (DE סמן)-תאים חיוביים. לאחר התבגרות נוספת במבחנה, תאים אלה הביעו סמנים ספציפיים בכבד ומורפולוגיה דמוית hepatocyte מופעל (מבוסס על כתמי המטוקסילין-אאוסין (H &E)) ופונקציות, כגון ספיגת ירוק אינדוקיאנין (ICG), אחסון גליקוגן ופעילות CYP3. התוצאות מראות כי hESCs ניתן להבדיל בהצלחה לתוך HLCs תפקודית בוגרת בשיטה זו והוא יכול לספק בסיס למחקר הקשורות למחלות כבד הקרנת תרופות במבחנה.
כאן, אנו מציגים שיטה חורגת שגורמת ל- HLCs מ- hESCs בשלושה שלבים. בשלב הראשון, Activin A ו- CHIR99021 שימשו כדי להבדיל HESCs לתוך DE. בשלב השני, KO-DMEM ו- DMSO שימשו כדי להבדיל DE לתאי אב בכבד. בשלב השלישי, HZM בתוספת HGF, OSM והידרוקורטיזון 21-hemisuccinate מלח נתרן שימשו כדי להמשיך להבדיל בין תאי אב בכבד לתוך HLCs.
יש…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מס ‘ 81870432 ו 81570567 X.L.Z.), (מס ‘81571994 P.N.S.); הקרן למדעי הטבע של מחוז גואנגדונג, סין (מס ‘ 2020A1515010054 כדי P.N.S.), קרן אוניברסיטת לי קה שינג Shantou (לא. L1111 2008 כדי P.N.S.). ברצוננו להודות לפרופ’ סטנלי לין מהמכללה הרפואית של אוניברסיטת שאנטו על ייעוץ שימושי.
2-Mercaptoethanol | Sigma | M7522 | For hepatic progenitor differentiation |
488 labeled goat against mouse IgG | ZSGB-BIO | ZF-0512 | For IF,second antibody |
488 labeled goat against Rabbit IgG | ZSGB-BIO | ZF-0516 | For IF,second antibody |
Accutase | Stem Cell Technologies | 7920 | For cell passage |
Activin A | peproTech | 120-14E | For definitive endoderm formation |
Anti – Albumin (ALB) | Sigma-Aldrich | A6684 | For IF and WB, primary antibody |
Anti – Human Oct4 | Abcam | Ab19587 | For IF, primary antibody |
Anti – α-Fetoprotein (AFP) | Sigma-Aldrich | A8452 | For IF and WB, primary antibody |
Anti -SOX17 | Abcam | ab224637 | For IF, primary antibody |
Anti-Hepatocyte Nuclear Factor 4 alpha (HNF4α) | Sigma-Aldrich | SAB1412164 | For IF, primary antibody |
B-27 Supplement | Gibco | 17504-044 | For definitive endoderm formation |
BSA | Beyotime | ST023-200g | For cell blocking |
CHIR99021 | Sigma-Aldrich | SML1046 | For definitive endoderm formation |
DAPI | Beyotime | C1006 | For nuclear staining |
DEPC-water | Beyotime | R0021 | For RNA dissolution |
DM3189 | MCE | HY-12071 | For definitive endoderm formation |
DMEM/F12 | Gibco | 11320-033 | For cell culture |
DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | For hepatic progenitor differentiation |
DPBS | Gibco | 14190-144 | For cell culture |
GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | For hepatic progenitor differentiation |
H&E staining kit | Beyotime | C0105S | For H&E staining |
Hepatocyte growth factor (HGF) | peproTech | 100-39 | For hepatocyte differentiation |
HepatoZYME-SFM (HZM) | Gibco | 17705-021 | For hepatocyte differentiation |
Hydrocortisone-21-hemisuccinate | Sigma-Aldrich | H4881 | For hepatocyte differentiation |
Indocyanine | Sangon Biotech | A606326 | For Indocyanine staining |
Knock Out DMEM | Gibco | 10829-018 | For hepatic progenitor differentiation |
Knock Out SR Multi-Species | Gibco | A31815-02 | For hepatic progenitor differentiation |
Matrigel hESC-qualified | Corning | 354277 | For cell culture |
MEM NeAA | Gibco | 11140-050 | For hepatic progenitor differentiation |
mTesR 5X Supplement | Stem Cell Technologies | 85852 | For cell culture |
mTesR Basal Medium | Stem Cell Technologies | 85851 | For cell culture |
Oncostatin (OSM) | peproTech | 300-10 | For hepatocyte differentiation |
P450 – CYP3A4 (Luciferin – PFBE) | Promega | V8901 | For CYP450 activity |
PAS staining kit | Solarbio | G1281 | For PAS staining |
Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | For cell differentiation |
Peroxidase-Conjugated Goat anti-Mouse IgG | ZSGB-BIO | ZB-2305 | For WB,second antibody |
Primary Antibody Dilution Buffer for Western Blot | Beyotime | P0256 | For primary antibody dilution |
ReverTraAce qPCR RT Kit | TOYOBO | FSQ-101 | For cDNA Synthesis |
RNAiso Plus | TaKaRa | 9109 | For RNA Isolation |
RPMI 1640 | Gibco | 11875093 | For definitive endoderm formation |
Skim milk | Sangon Biotech | A600669 | For second antibody preparation |
SYBR Green Master Mix | Thermo Fisher Scientific | A25742 | For RT-PCR Analysis |
Torin2 | MCE | HY-13002 | For definitive endoderm formation |
Tween | Sigma-Aldrich | WXBB7485V | For washing buffer preparation |