Summary

Eine effiziente Methode zur gerichteten Hepatozyten-ähnlichen Zellinduktion aus menschlichen embryonalen Stammzellen

Published: May 06, 2021
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Summary

Dieses Manuskript beschreibt ein detailliertes Protokoll zur Differenzierung menschlicher embryonaler Stammzellen (hESCs) in funktionelle hepatozytenähnliche Zellen (HLCs) durch kontinuierliche Ergänzung von Activin A und CHIR99021 während der hESC-Differenzierung zu definitivem Endoderm (DE).

Abstract

Die potenziellen Funktionen von Hepatozyten-ähnlichen Zellen (HLCs), die aus menschlichen embryonalen Stammzellen (hESCs) gewonnen werden, sind vielversprechend für die Krankheitsmodellierung und Das Screening von Medikamenten. Hier steht eine effiziente und reproduzierbare Methode zur Differenzierung von hESCs in funktionelle HLCs zur Verfügung. Die Etablierung einer Endoderm-Linie ist ein wichtiger Schritt bei der Differenzierung zu HLCs. Mit unserer Methode regulieren wir die wichtigsten Signalwege, indem wir Activin A und CHIR99021 während der hESC-Differenzierung kontinuierlich in definitives Endoderm (DE) ergänzen, gefolgt von der Generierung von hepatischen Vorläuferzellen und schließlich HLCs mit typischer Hepatozytenmorphologie in einer stufenweisen Methode mit vollständig definierten Reagenzien. Die mit dieser Methode hergestellten hESC-abgeleiteten HLCs exprimieren stadiumsspezifische Marker (einschließlich Albumin, HNF4α-Kernrezeptor und Natriumtaurocholat-Cotransport-Polypeptid (NTCP)) und zeigen besondere Eigenschaften im Zusammenhang mit reifen und funktionellen Hepatozyten (einschließlich Indocyanin-Grünfärbung, Glykogenspeicherung, Hämatoxylin-Eosin-Färbung und CYP3-Aktivität) und können eine Plattform für die Entwicklung von HLC-basierten Anwendungen in der Untersuchung von Lebererkrankungen bieten.

Introduction

Die Leber ist ein stark metabolisches Organ, das mehrere Rollen spielt, einschließlich Desoxidation, Speicherung von Glykogen und Sekretion und Synthese von Proteinen1. Verschiedene Krankheitserreger, Medikamente und Vererbung können pathologische Veränderungen in der Leber verursachen und ihre Funktionen beeinflussen2,3. Hepatozyten als Hauptfunktionseinheit der Leber spielen eine wichtige Rolle bei künstlichen Leberunterstützungssystemen und der Eliminierung der Arzneimitteltoxizität. Die Ressource primärer humaner Hepatozyten ist jedoch sowohl in der zellbasierten Therapie als auch in der Lebererkrankungsforschung begrenzt. Daher ist die Entwicklung neuer Quellen funktioneller menschlicher Hepatozyten eine wichtige Forschungsrichtung im Bereich der regenerativen Medizin. Seit 1998, als hESCs etabliert wurden4, wurden hESCs von Forschern wegen ihres überlegenen Differenzierungspotenzials (sie können sich in einer geeigneten Umgebung in verschiedene Gewebe differenzieren) und eines hohen Grades an Selbsterneuerbarkeit weithin in Betracht gezogen und bieten somit ideale Quellzellen für biokünstliche Lebern, Hepatozytentransplantation und sogar Lebergewebe-Engineering5.

Derzeit kann die hepatische Differenzierungseffizienz durch Anreicherung des Endoderms6stark erhöht werden. Bei der Liniendifferenzierung von Stammzellen in Endoderm sind ebenen des transformierenden Wachstumsfaktors β (TGF-β) Signalwege und WNT-Signalwege die Schlüsselfaktoren im Knoten des Endodermbildungsstadiums. Die Aktivierung eines hohen TGF-β- und WNT-Signals kann die Entwicklung von Endoderm7,8fördern. Activin A ist ein Zytokin, das zur TGF-β-Superfamilie gehört. Daher wird Activin A häufig in der Endoderminduktion von human induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) und hESCs9,10verwendet. GSK3 ist eine Serin-Threonin-Proteinkinase. Forscher haben herausgefunden, dass CHIR99021, ein spezifischer Inhibitor von GSK3β, typische WNT-Signale stimulieren und unter bestimmten Bedingungen die Stammzelldifferenzierung fördern kann, was darauf hindeutet, dass CHIR99021 das Potenzial hat, die Stammzelldifferenzierung in Endoderm 11,12,13zu induzieren.

Hier berichten wir über eine effiziente und reproduzierbare Methode, um die Differenzierung von hESCs in funktionelle HLCs effektiv zu induzieren. Die sequentielle Zugabe von Activin A und CHIR99021 erzeugte etwa 89,7±0,8% SOX17 (DE-Marker)-positive Zellen. Nach der weiteren Reifung in vitroexprimierten diese Zellen leberspezifische Marker und übten eine hepatozytenähnliche Morphologie (basierend auf Hämatoxylin-Eosin-Färbung (H & E)) und Funktionen wie die Aufnahme von Indocyaningrün (ICG), Glykogenspeicherung und CYP3-Aktivität aus. Die Ergebnisse zeigen, dass hESCs mit dieser Methode erfolgreich in reife funktionelle HLCs differenziert werden können und eine Grundlage für leberkrankheitsbezogene Forschung und In-vitro-Wirkstoffscreening bieten können.

Protocol

1. Stammzellpflege HINWEIS: Das unten beschriebene Zellwartungsprotokoll gilt für die hES03-Zelllinie, die in einer adhärenten Monoschicht gepflegt wird. Für alle folgenden Protokolle in diesem Manuskript sollten Zellen unter einer biologischen Sicherheitswerkbank behandelt werden. Bereiten Sie 1x mTesR-Stammzellkulturmedium vor, indem Sie 5x Ergänzungsmedium auf mTesR-Basismedium verdünnen. Bereiten Sie 30x hESC-qualifiziertes Matrigelmedium vor, indem Sie 5 ml hESC-q…

Representative Results

Das schematische Diagramm der HLC-Induktion von hESCs und repräsentative Hellfeldbilder jeder Differenzierungsstufe sind in Abbildung 1 dargestellt. Im Stadium I wurden Activin A und CHIR99021 für 3 Tage hinzugefügt, um Stammzellen zur Bildung von Endodermzellen zu induzieren. Im Stadium II differenzierten sich die Endodermzellen nach 5-tägiger Behandlung mit Differenzierungsmedium zu leberförmigen Vorläuferzellen. Im Stadium III waren frühe Hepatozyten nach 10 Tagen in HGF und OSM ge…

Discussion

Hier stellen wir eine schrittweise Methode vor, die HLCs aus hESCs in drei Stufen induziert. In der ersten Stufe wurden Activin A und CHIR99021 verwendet, um hESCs in DE zu unterscheiden. In der zweiten Stufe wurden KO-DMEM und DMSO verwendet, um DE in hepatische Vorläuferzellen zu differenzieren. In der dritten Stufe wurden HZM plus HGF, OSM und Hydrocortison-21-Hemisuccinat-Natriumsalz verwendet, um die hepatischen Vorläuferzellen weiterhin in HLCs zu differenzieren.

Die folgenden kritisch…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (Nr. 81870432 und 81570567 zu X.L.Z.), (Nr. 81571994 zu P.N.S.) unterstützt; die Natural Science Foundation der Provinz Guangdong, China (Nr. 2020A1515010054 bis P.N.S.), Die Li Ka Shing Shantou University Foundation (Nr. L1111 2008 bis P.N.S.). Wir danken Prof. Stanley Lin vom Shantou University Medical College für nützliche Ratschläge.

Materials

2-Mercaptoethanol Sigma M7522 For hepatic progenitor differentiation
488 labeled goat against mouse IgG ZSGB-BIO ZF-0512 For IF,second antibody
488 labeled goat against Rabbit IgG ZSGB-BIO ZF-0516 For IF,second antibody
Accutase Stem Cell Technologies 7920 For cell passage
Activin A peproTech 120-14E For definitive endoderm formation
Anti – Albumin (ALB) Sigma-Aldrich A6684 For IF and WB, primary antibody
Anti – Human Oct4 Abcam Ab19587 For IF, primary antibody
Anti – α-Fetoprotein (AFP) Sigma-Aldrich A8452 For IF and WB, primary antibody
Anti -SOX17 Abcam ab224637 For IF, primary antibody
Anti-Hepatocyte Nuclear Factor 4 alpha (HNF4α) Sigma-Aldrich SAB1412164 For IF, primary antibody
B-27 Supplement Gibco 17504-044 For definitive endoderm formation
BSA Beyotime ST023-200g For cell blocking
CHIR99021 Sigma-Aldrich SML1046 For definitive endoderm formation
DAPI Beyotime C1006 For nuclear staining
DEPC-water Beyotime R0021 For RNA dissolution
DM3189 MCE HY-12071 For definitive endoderm formation
DMEM/F12 Gibco 11320-033 For cell culture
DMSO Sigma-Aldrich D5879 For hepatic progenitor differentiation
DPBS Gibco 14190-144 For cell culture
GlutaMAX Gibco 35050-061 For hepatic progenitor differentiation
H&E staining kit Beyotime C0105S For H&E staining
Hepatocyte growth factor (HGF) peproTech 100-39 For hepatocyte differentiation
HepatoZYME-SFM (HZM) Gibco 17705-021 For hepatocyte differentiation
Hydrocortisone-21-hemisuccinate Sigma-Aldrich H4881 For hepatocyte differentiation
Indocyanine Sangon Biotech A606326 For Indocyanine staining
Knock Out DMEM Gibco 10829-018 For hepatic progenitor differentiation
Knock Out SR Multi-Species Gibco A31815-02 For hepatic progenitor differentiation
Matrigel hESC-qualified Corning 354277 For cell culture
MEM NeAA Gibco 11140-050 For hepatic progenitor differentiation
mTesR 5X Supplement Stem Cell Technologies 85852 For cell culture
mTesR Basal Medium Stem Cell Technologies 85851 For cell culture
Oncostatin (OSM) peproTech 300-10 For hepatocyte differentiation
P450 – CYP3A4 (Luciferin – PFBE) Promega V8901 For CYP450 activity
PAS staining kit Solarbio G1281 For PAS staining
Pen/Strep Gibco 15140-122 For cell differentiation
Peroxidase-Conjugated Goat anti-Mouse IgG ZSGB-BIO ZB-2305 For WB,second antibody
Primary Antibody Dilution Buffer for Western Blot Beyotime P0256 For primary antibody dilution
ReverTraAce qPCR RT Kit TOYOBO FSQ-101 For cDNA Synthesis
RNAiso Plus TaKaRa 9109 For RNA Isolation
RPMI 1640 Gibco 11875093 For definitive endoderm formation
Skim milk Sangon Biotech A600669 For second antibody preparation
SYBR Green Master Mix Thermo Fisher Scientific A25742 For RT-PCR Analysis
Torin2 MCE HY-13002 For definitive endoderm formation
Tween Sigma-Aldrich WXBB7485V For washing buffer preparation

References

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Cite This Article
Zhou, Q., Xie, X., Zhong, Z., Sun, P., Zhou, X. An Efficient Method for Directed Hepatocyte-Like Cell Induction from Human Embryonic Stem Cells. J. Vis. Exp. (171), e62654, doi:10.3791/62654 (2021).

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