Ici, nous décrivons un protocole de réglage fin des régions d’intérêt (ROI) pour les technologies Spatial Omics afin de mieux caractériser le microenvironnement tumoral et d’identifier des populations cellulaires spécifiques. Pour les tests protéomiques, des protocoles personnalisés automatisés peuvent guider la sélection du retour sur investissement, tandis que les tests transcriptomiques peuvent être affinés en utilisant des retours sur investissement aussi petits que 50 μm.
Le multiplexage permet d’évaluer plusieurs marqueurs sur un même tissu tout en fournissant un contexte spatial. Les technologies Spatial Omics permettent le multiplexage des protéines et de l’ARN en exploitant respectivement les anticorps et les sondes oligo-marqués photo-clivables. Les oligos sont clivés et quantifiés à partir de régions spécifiques du tissu pour élucider la biologie sous-jacente. Ici, l’étude démontre que des protocoles automatisés de visualisation d’anticorps personnalisés peuvent être utilisés pour guider la sélection du retour sur investissement en conjonction avec les tests de protéomique spatiale. Cette méthode spécifique n’a pas montré de performances acceptables avec les tests de transcriptomique spatiale. Le protocole décrit le développement d’un test d’immunofluorescence (IF) 3-plex pour la visualisation de marqueurs sur une plate-forme automatisée, en utilisant l’amplification du signal tyramide (TSA) pour amplifier le signal fluorescent d’une cible protéique donnée et augmenter le pool d’anticorps parmi lesquels choisir. Le protocole de visualisation a été automatisé à l’aide d’un test 3-plex soigneusement validé pour assurer la qualité et la reproductibilité. En outre, l’échange de DAPI contre des colorants SYTO a été évalué pour permettre l’imagerie des tests IF basés sur TSA sur la plate-forme de profilage spatial. De plus, nous avons testé la capacité de sélectionner de petits ROI à l’aide du test de transcriptomique spatiale pour permettre l’investigation de domaines d’intérêt très spécifiques (par exemple, les zones enrichies pour un type de cellule donné). Des ROI de 50 μm et 300 μm de diamètre ont été collectés, ce qui correspond à environ 15 cellules et 100 cellules, respectivement. Les échantillons ont été transformés en bibliothèques et séquencés pour étudier la capacité de détecter les signaux provenant de petits retours sur investissement et de régions spécifiques au profil du tissu. Nous avons déterminé que les technologies de protéomique spatiale bénéficient grandement de protocoles automatisés et normalisés pour guider la sélection du retour sur investissement. Bien que ce protocole de visualisation automatisé n’était pas compatible avec les tests de transcriptomique spatiale, nous avons pu tester et confirmer que des populations cellulaires spécifiques peuvent être détectées avec succès même dans de petits retours sur investissement avec le protocole de visualisation manuelle standard.
Les progrès des techniques de multiplexage continuent de fournir de meilleurs outils de caractérisation des cibles présentes dans les tumeurs. Le microenvironnement tumoral (TME) est un système complexe de cellules tumorales, infiltrant les cellules immunitaires, et de stroma, où l’information spatiale est essentielle pour mieux comprendre et interpréter les mécanismes d’interaction entre les biomarqueurs d’intérêt1. Avec des techniques émergentes telles que le GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP) et 10x Visium, plusieurs cibles peuvent être détectées et quantifiées simultanément dans leur contexte spatial. L’utilisation de protocoles d’immunofluorescence qui facilitent la visualisation des tissus peut améliorer davantage les capacités de profilage spatial de ces technologies.
La technologie Spatial Omics sur laquelle nous nous sommes concentrés pour le développement de cette méthode consiste en des tests de protéomique spatiale et de transcriptomique où les oligonucléotides sont attachés à des anticorps ou à des sondes à ARN via un liant photoclivable sensible aux UV. Les lames histologiques sont marquées avec ces anticorps ou sondes oligo-conjugués, puis imagées sur la plateforme de profilage spatial. Ensuite, des ROI de différentes tailles et formes sont sélectionnés pour l’éclairage, et les oligonucléotides photoclivés sont aspirés et collectés dans une plaque de 96 puits. Les oligonucléotides photoclivés sont préparés pour être quantifiés soit avec le système Nanostring nCounter, soit avec le séquençage de nouvelle génération (NGS)2,3 (Figure 1)4,5.
Les distributions cellulaires varient au sein des tissus, et la capacité de caractériser des emplacements spécifiques des cellules à l’aide de marqueurs sélectionnés et de différentes tailles de retour sur investissement est d’une grande importance pour bien comprendre l’environnement tissulaire et identifier des caractéristiques spécifiques. Dans la technologie Spatial Omics mentionnée ici, le protocole de visualisation standard utilise des anticorps directement conjugués et est un protocole manuel. Les marqueurs standard pour distinguer la tumeur du stroma sont la pancytokératine (panCK) et CD456,7, mais des marqueurs supplémentaires sont nécessaires pour cibler des populations cellulaires spécifiques d’intérêt. De plus, l’utilisation d’anticorps fluorescents directement conjugués manque d’amplification, ce qui limite la sélection des anticorps à des marqueurs abondants. De plus, les tests manuels sont soumis à plus de variabilité que les flux de travail automatisés8. Par conséquent, il est souhaitable de disposer d’un protocole de visualisation personnalisable, automatisé et amplifié pour la sélection du retour sur investissement.
Ici, l’étude démontre que, pour les tests de protéomique spatiale, la technologie TSA peut être utilisée pour les protocoles de visualisation sur une plate-forme automatisée, ce qui permet un test plus ciblé et standardisé. En outre, les tests basés sur la TSA permettent l’utilisation de marqueurs à faible expression, augmentant ainsi la gamme de cibles pouvant être sélectionnées pour la visualisation. Un test 3-plex pour panCK, FAP et anticorps X a été développé à l’aide d’une plate-forme automatisée où panCK et FAP ont été utilisés pour différencier la tumeur et le stroma, respectivement. L’anticorps X est une protéine stromale fréquemment rencontrée dans les tumeurs, mais sa biologie et son impact sur l’immunité antitumorale ne sont pas entièrement compris. La caractérisation de la contexture immunitaire dans les zones riches en anticorps X peut élucider son rôle dans l’immunité antitumorale et la réponse thérapeutique, ainsi que son potentiel en tant que cible médicamenteuse.
Bien que les panels de visualisation automatisés personnalisés de la TSA se soient avérés efficaces pour les tests de protéomique spatiale, l’application de ces tests pour les tests de transcriptomique spatiale n’a pas pu être confirmée. Cela est probablement dû aux réactifs et au protocole utilisés pour les protocoles de visualisation automatisés, qui semblent compromettre l’intégrité de l’ARN. Reconnaître qu’un protocole d’étiquetage automatisé pour les marqueurs de visualisation peut être utilisé pour les tests de protéomique spatiale, mais pas pour les tests de transcriptomique spatiale, fournit des conseils importants sur les conceptions de tests de la technologie Spatial Omics.
De plus, l’étude démontre que le test de transcriptomique spatiale peut être utilisé pour profiler des cibles dans des régions aussi petites que 50 μm de diamètre, soit environ 15 cellules. Deux ROI de tailles différentes ont été sélectionnés pour tester la capacité du test à détecter également les transcrits dans les petits ROI. Pour chaque région d’intérêt, des oligos correspondant à 1 800 cibles d’ARNm ont été collectés et transformés en bibliothèques selon le protocole de la plateforme de profilage spatial. Les bibliothèques ont été indexées individuellement, puis regroupées et séquencées. Cela a permis d’évaluer à la fois l’efficacité de la mise en commun et la capacité d’identifier des populations cellulaires spécifiques dans de petits retours sur investissement.
Cet article montre que pour les tests de protéomique spatiale, un protocole automatisé pour guider la sélection du retour sur investissement sur des marqueurs d’intérêt spécifiques peut être utilisé pour cibler sélectivement l’interrogation des zones tissulaires pertinentes et caractériser l’environnement spatial du tissu. De plus, nous démontrons que des retours sur investissement plus petits peuvent être utilisés pour les tests transcriptomiques spatiaux afin de détecter et de caractériser des populations cellulaires spécifiques.
À ce jour, les anticorps fluorescents directement conjugués dans un protocole manuel sont le plus souvent utilisés comme panneaux de visualisation pour la protéomique spatiale ou les tests de transcriptomiquespatiale 9,10. Cependant, l’utilisation d’anticorps fluorescents directement conjugués peut être difficile pour les marqueurs moins abondants, ce qui limite la sélection d’anticorps appropriés. Ce protocole montre que l’étiquetage des marqueu…
The authors have nothing to disclose.
Les auteurs remercient Thomas Wu pour le traitement des fichiers NGS. Nous remercions James Ziai pour les discussions sur les résultats et la révision des manuscrits, ainsi que Meredith Triplet et Rachel Taylor pour la révision interne du manuscrit.
10x Tris buffered saline (TBS) | Cell Signaling Technologies | 12498S | Diluted to 1x TBS in DEPC treated water |
Antibody X (not disclosed) | antibody blinded due to confidentiality | ||
DEPC-treated water | ThermoFisher | AM9922 | Another can be used |
DISCOVERY Cell Conditioning ( CC1) | Ventana | 950-500 | |
DISCOVERY Cy5 Kit | Ventana | 760-238 | Referred as Cy5 |
DISCOVERY FAM Kit | Ventana | 760-243 | Referred as FAM |
DISCOVERY Goat Ig Block | Ventana | 760-6008 | Referred as Gt Ig Block |
DISCOVERY OmniMap anti-Ms HRP | Ventana | 760-4310 | Referred as OMap anti-Ms HRP |
DISCOVERY OmniMap anti-Rb HRP | Ventana | 760-4311 | Referred as OMap anti-Rb HRP |
DISCOVERY Rhodamine 6G Kit | Ventana | 760-244 | Referred as Rhodamine 6G |
DISCOVERY ULTRA Automated Slide Preparation System | Ventana | 05 987 750 001 / N750-DISU-FS | Referred as autostainer on the manuscript |
FAP [EPR20021] Antibody | Abcam | Ab207178 | |
GeoMx Digital Spatial Profiler | NanoString | GMX-DSP-1Y | Referred as spatial profiling platform on the manuscript |
Humidity chamber | Simport | M920-2 | Another can be used |
Pan-Cytokeratin [AE1/AE3] Antibody | Abcam | Ab27988 | |
ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher | P36934 | |
Python | Python | Statistical analysis | |
Reaction Buffer (10x) | Ventana | 950-300 | |
Statistical analysis software | GraphPad | Prism 7 | Statistical analysis |
SYTO 64 | ThermoFisher | S11346 | |
ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC2) | Ventana | 950-223 | |
Ventana Antibody Diluent with Casein | Ventana | 760-219 | Referred as specified diluent on the manuscript |
Ventana Primary antibody dispenser | Ventana | Catalog number depends on dispenser number |